Как похудела пугачева фото на 51 кг: диета, фотографии до и после процедуры

Учитывая экспрессию Sin в mTEC и дефектный mTEC-опосредованный отрицательный отбор в отсутствие of Sin, мы исследовали, влияет ли устранение экспрессии Sin на развитие мозгового вещества тимуса. Предыдущие эксперименты показали, что небольшие костные островки у новорожденных мышей расширяются и сливаются, образуя сплоченную центрально расположенную мозговую область в течение первых недель возраста (Rodewald et al., 2001; Ян и др., 2006). Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) срезов тимуса, залитых парафином, выявило небольшие костномозговые островки у новорожденных животных дикого типа и животных Sin ^{– / –} (, вверху), которые разрослись и слились в центрально расположенных структурах через неделю после рождения в дикой природе. введите мышки (, слева посередине). Напротив, дефицит Sin коррелировал с диспергированными / дезорганизованными областями мозгового вещества, которые сохранялись у взрослых мышей с нокаутом (справа, в середине и внизу). Гистологическое исследование пяти срезов вилочковой железы на расстоянии 200 мкм выявило уменьшение общей площади костного мозга и большее количество островков костного мозга в тимусе взрослых животных Sin ^{– / –} по сравнению с контролем ().

Дефицит Sin приводит к неорганизованной архитектуре костного мозга. (A) Тимус выделяли от животных дикого типа и животных Sin ^{– / –} в разном возрасте (NB, новорожденные; W, неделя), а срезы долей тимуса, окрашенные H&E, анализировали с помощью световой микроскопии. Штанга, 200 мкм. (B) Общая площадь костного мозга и количество островков были рассчитаны для 5 срезов, охватывающих срез тимуса размером 200 мкм от животных дикого типа в возрасте 5–6 недель и животных Sin ^{– / –} . Для A и B, по крайней мере, пять мышей в группе были проанализированы в трех отдельных экспериментальных группах.Среднее + SE отображается на графиках. *, P <0,05. (C и D) Замороженные срезы тимуса мышей дикого типа и мышей Sin ^{– / –} окрашивали UEA (красный, слева) или MHCII (красный, справа), чтобы выявить мозговую область, и совместно окрашивали анти-Aire ( зеленый). Изображения представляют четыре независимых эксперимента. Пруток, 30 мкм.

Медуллярные ТЭК содержат концевые L-фукозильные остатки, которые связываются с растительным лектином ulex europaeus agglutinin-1 (UEA-1; Farr and Anderson, 1985). Функциональное созревание mTEC UEA ⁺ отмечено повышением регуляции молекул MHCII и регулятора транскрипции Aire (Tykocinski et al., 2008). Срезы тимуса из тех же временных точек, изображенных в окрашенных UEA-1, или тимуса взрослых, окрашенных медуллярными и кортикальными маркерами Кератин 5 и Кератин 8, соответственно, выявили аналогичные мозговые структуры, как отмечено с помощью H&E (рис. S4, A и B). . Срезы тимуса взрослых животных, окрашенные UEA-1 или антителами против MHCII и Aire, показали пониженное окрашивание для UEA ⁺ MHCII ⁺ Aire ⁺ mTEC в Sin ^{– / –} тими по сравнению с контролем ().В совокупности эти результаты предполагают, что дефицит Sin ведет к дезорганизованной архитектуре костного мозга и, возможно, к снижению числа функционально зрелых субпопуляций UEA ⁺ mTEC.

Чтобы определить, коррелирует ли кажущееся медуллярное снижение Sin ^{– / –} тимуса с количественным снижением мТЕС UEA ⁺ , были диспергированы отдельные тимус и общее количество ТЕС UEA ⁺ было определено с помощью проточной цитометрии. Действительно, мыши Sin ^{– / –} продемонстрировали значительное снижение общего числа mTEC UEA ⁺ MHCII ⁺ , тогда как в популяции UEA ^– MHCII ⁺ cTEC не наблюдалось различий по сравнению с дикими мышами. типа животные ().В компартменте MHCII mTEC UEA ⁺ , CD80 / 86 и Aire используются для различения функционально отличной популяции. Например, недавние исследования показывают, что mTEC CD80 / MHCII ^lo Aire ^– дают начало клеткам CD80 / MHCII ^hi Aire ⁺ , которые рассматриваются как функционально зрелые mTEC (Gäbler et al., 2007; Gray et al. ., 2007; Росси и др., 2007б). Дефицит Sin привел к значительному снижению количества клеток UEA ⁺ MHCII ^hi mTEC, тогда как умеренное снижение количества клеток UEA ⁺ MHCII ^lo не было статистически значимым ().Сходные результаты наблюдались, когда суспензии стромальных клеток были окрашены и mTEC были идентифицированы как клетки LY51 ^lo G8.8 ⁺ MHCII ⁺ (фиг. S5, A и B). Хотя популяция mTEC LY51 ^lo G8.8 ⁺ MHCII ^hi была значительно снижена в отсутствие экспрессии Sin (рис. S5 C, левый график), LY51 ^lo G8.8 ⁺ MHCII ^lo mTEC (рис. S5 C, правый график) и LY51 ^hi G8.8 ⁺ MHCII ⁺ популяции cTEC (рис.S5 D) не были затронуты.

Sin ^{– / –} животных уменьшили общее количество UEA ⁺ MHCII ^hi mTECs. (A) Отдельные тимусы мышей дикого типа и мышей с нокаутом анализировали на общее количество CD45 ^– UEA ⁺ MHCII ⁺ mTEC (прямоугольные ворота) и CD45 ^– UEA ^– MHCII ⁺ cTEC (круглые ворота) методом проточной цитометрии. (B) Общее количество mTEC CD45 ^– UEA ⁺ MHCII ^hi и CD45 ^– UEA ⁺ MHCII ^lo определяли из тех же клеточных препаратов, что и в A.Графики показывают среднее значение + SE. *, P <0,01; **, P <0,005. По крайней мере, шесть животных были проанализированы на каждый генотип в двух независимых экспериментах.

В отдельных экспериментах и ​​с учетом уменьшенного окрашивания Aire в срезах тимуса, наблюдаемом в, мы исследовали влияние дефицита Sin на количество функционально зрелых мТЕС, экспрессирующих Aire. Отсутствие экспрессии Sin привело к уменьшению количества клеток UEA ⁺ MHCII ⁺ Aire ⁺ (), предполагая, что Sin необходим для нормального созревания mTEC.В соответствии со снижением зрелых мТЕС, количественный анализ ПЦР (кПЦР) с использованием мРНК, полученной из препаратов общих ТЕС, выявил пониженные уровни MHCII, CD80 и Aire в Sin ^{– / –} ТЕС по сравнению с контролями дикого типа (левый график) . Эти анализы также выявили снижение экспрессии большинства, но не всех тестируемых Aire-зависимых и Aire-независимых антигенов (). Напротив, дефицит Sin не влияет на экспрессию хемокина CCL21 или cTEC Cathepsin-L- и mTEC cathepsin-S-специфических протеаз (, правый график).Дальнейшие анализы кПЦР с использованием мРНК из отсортированных зрелых UEA ⁺ MHCII ^hi популяций mTEC, полученных из возрастных групп животных дикого типа или животных с нокаутом Sin, не выявили значительного влияния дефицита Sin на MHCII, CD80, Aire и репрезентативные TRA. выражение (). Эти данные предполагают, что снижение экспрессии поверхностных маркеров и TRA, наблюдаемое во всей фракции TEC, было вызвано уменьшением количества зрелых mTEC, а не прямым влиянием дефицита Sin на экспрессию TRA.В совокупности эксперименты, представленные выше, показывают, что дефицит Sin приводит к потере когезионных медуллярных областей, дефектному созреванию mTEC и, как следствие, снижению экспрессии TRA. Эти эффекты, возможно, являются причиной дефектного отрицательного отбора антиген-специфических Т-клеток и развития аутоиммунитета, наблюдаемого у мышей с нокаутом Sin.

Уменьшение количества клеток UEA ⁺ MHCII ⁺ Aire ⁺ коррелирует со снижением экспрессии TRA в тимусе Sin ^{– / –} . (A) Суспензии стромальных клеток из отдельных тимусов окрашивали, как описано выше, с добавлением Aire-специфических антител, и мТЕС UEA ⁺ MHCII ⁺ Aire ⁺ определяли с помощью проточной цитометрии. Гистограмма представляет собой среднее значение по крайней мере шести мышей на каждый генотип из двух независимых испытаний + SE. **, P <0,00005. (B и C) Отсортированные целые фракции, обогащенные ТЕС, от отдельных тимусов дикого типа и Sin ^{– / –} , были проанализированы с помощью кПЦР для указанных генов с использованием специфических праймеров.Графики показывают среднее значение по крайней мере двух индивидуальных экспериментов, по крайней мере, с четырьмя животными на каждый генотип + SE. (D) UEA ⁺ MHCII ^hi популяции mTEC, отсортированные из объединенных групп дикого типа или нокаута тимуса ( n ≥ 5 каждая), анализировали на экспрессию указанных генов с помощью qPCR. Графики показывают среднее значение двух независимых выборок на один прогон генотипа в четырех повторностях + SE и представляют два эксперимента. Анализ относительной экспрессии гена был нормализован до GAPDH с использованием метода 2 ^-ΔΔCt , и образец дикого типа был установлен на 1 для каждого тестируемого гена.Акронимы генов: I-FABP, белок, связывающий жирные кислоты кишечника; Spt1, белок 1 слюны; nAchr-1 , холинергический рецептор, никотиновый, α-полипептид 1; CRP , С-реактивный белок; FABP9 , белок, связывающий жирные кислоты 9; GAD67, декарбоксилаза глутаминовой кислоты. *, P <0,05.

Sin регулирует опосредованную фактором роста экспансию mTEC

Учитывая сниженное количество зрелых mTECs у мышей с нокаутом Sin, мы предположили, что Sin регулирует устойчивое состояние и / или индуцированную фактором роста пролиферацию mTECs во взрослой вилочковой железе.Чтобы проверить эту гипотезу, ТЕС, очищенные от мышей дикого типа и мышей Sin ^{– / –} , окрашивали антителами к CD45 и MHCII, UEA-1 и антителами против маркера пролиферации Ki67. Эти эксперименты выявили значительное снижение процентного содержания и общего количества пролиферирующих мТЕС ⁺ MHCII ⁺ Ki67 ⁺ у животных с нокаутом по сравнению с контрольными животными (). Ранее описанный быстрый оборот популяций mTEC во взрослой вилочковой железе (Gray et al., 2007) побудили исследовать кумулятивное стационарное расширение популяций mTEC в отсутствие Sin. Как и в экспериментах по маркировке Ki67, у мышей, которым вводили маркер пролиферации BrdU при непрерывном воздействии BrdU в течение 3 дней, наблюдалось значительно меньшее процентное содержание и общее количество мТЕС UEA ⁺ MHCII ⁺ BrdU ⁺ (рис. S6). Напротив, не было значительных различий в UEA ^– MHCII ⁺ Ki67 ⁺ или UEA ^– MHCII ⁺ BrdU ⁺ cTEC у мышей с нокаутом Sin по сравнению с контрольными мышами (и рис.S6). В совокупности эти результаты предполагают, что Sin необходим для поддержания нормальной скорости пролиферации mTEC и гомеостаза mTEC во взрослом тимусе.

Пониженная скорость пролиферации и блокирование индуцированной факторами роста экспансии UEA ⁺ mTECs в отсутствие экспрессии Sin. (A) Процентное содержание и общее количество клеток CD45 ^– UEA ⁺ MHCII ⁺ Ki67 ⁺ клеток определяли методом проточной цитометрии. Гистограмма представляет собой среднее значение по меньшей мере восьми мышей на каждый генотип в двух независимых экспериментах + SE.*, P <0,05. (B – E) ТЕС, очищенные из отдельных тимусов мышей дикого типа, инъецированных PBS или KGF, или мышей Sin ^{– / –} , анализировали с помощью проточной цитометрии на общее количество клеток в разных воротах, как показано. Для выявления эффекта по лечению и эффекта по генотипу в B – E, где P <0,05, использовался дисперсионный анализ, за ​​которым следовал post ho c Fisher PLSD, используемый для групповых сравнений. # сравнивает лечение в пределах одного и того же генотипа, а * сравнивает лечение между генотипами дикого типа и нокаутом.**, P <0,001; ***, P ≤ 0,0005; ##, P <0,001; ###, P <0,0005. (E) **, P <0,005; #, P <0,005 Столбцы представляют собой среднее значение + SE. В каждой экспериментальной группе было использовано 4–7 мышей из двух независимых экспериментов. (F) ОТ-ПЦР для FGFR2IIIb проводили на отсортированных очищенных мТЕС. Образцы были нормализованы на основе относительных уровней β-актина. Показан представитель двух экспериментов.

KGF (также известный как фактор роста фибробластов-7) представляет собой растворимый фактор, регулирующий митогенез и дифференцировку эпителиальных клеток (Finch and Rubin, 2004).KGF проявляет свои эффекты путем связывания со сплайсинговым вариантом семейства рецепторов фактора роста фибробластов, рецептором FGFR2IIIb, экспрессируемым в кератиноцитах, а также в TEC (auf demKeller et al., 2004; Rossi et al., 2007a). У взрослых тимусов KGF экспрессируется мезенхимальными клетками и тимоцитами и контролирует постнатальное развитие тимуса (Alpdogan et al., 2006; Rossi et al., 2007a). Введение KGF in vivo приводит к расширению гипопластического медуллярного компартмента в зачатке тимуса мышей Rag ^{– / –} (Erickson et al., 2002), тогда как инъекция KGF взрослым мышам дикого типа индуцирует временную экспансию незрелых mTECs и способствует их дифференцировке в зрелые mTECs (Rossi et al., 2007a). Эти наблюдения, а также уменьшенное количество циклических mTECs у мышей с нокаутом Sin побудили нас изучить, играет ли Sin роль в KGF-опосредованной экспансии mTECs. Введение KGF привело к заметному увеличению общего количества клеток UEA ⁺ MHCII ⁺ у животных дикого типа по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель ().Поразительно, но Sin требовался для расширения mTEC UEA ⁺ MHCII ⁺ в ответ на инъекцию KGF (). Дальнейший анализ субпопуляций mTEC UEA ⁺ MHCII ^hi и UEA ⁺ MHCII ^lo показал, что введение KGF индуцировало рост обеих субпопуляций в компартменте UEA ⁺ у животных дикого типа (). Это расширение было заблокировано у мышей Sin ^{– / –} , что подтверждает роль Sin в росте клеток-предшественников и созревании mTECs.Отсутствие экспансии mTEC у мышей Sin ^{– / –} не было связано со снижением уровней рецепторов, поскольку экспрессия FGFR2IIIb была аналогичной или более высокой в ​​mTEC Sin ^{– / –} по сравнению с контролем ().

Ранее было показано, что введение KGF способствует экспансии cTECs, предположительно за счет стимуляции минорной субпопуляции Keratin-18 ⁺ cTECs, которые экспрессируют FGFR2IIIb (Rossi et al., 2007a). В соответствии с этим мы обнаружили заметное увеличение общего количества UEA ^– MHCII ⁺ cTECs у животных дикого типа, получавших KGF ().Удивительно, учитывая почти неопределяемую экспрессию Sin в коре и cTEC (), нормальный положительный отбор тимоцитов у мышей Sin ^{– / –} (рис. S3) и отсутствие влияния дефицита Sin на устойчивое состояние. Числа cTEC () или пролиферация cTEC (и фиг. S5), KGF-опосредованная экспансия cTEC заметно подавлялась в отсутствие экспрессии Sin (). Этот эффект может быть вызван KGF-опосредованной экспансией популяции предшественников, которая предшествует дифференцировке клонов как mTEC, так и cTEC, или временным повышением экспрессии Sin во время экспансии cTEC.Вместе эти данные показывают, что Sin является важным медиатором KGF-индуцированного расширения популяций TEC, и предполагают, что Sin регулирует опосредованное факторами роста созревание mTECs из функционально незрелых предшественников.

ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее мы показали, что дефицит Sin приводит к развитию воспалительных инфильтратов против множества тканей у старых животных (Donlin et al., 2005). В этом исследовании мы изучили механизм, посредством которого дефицит Sin приводит к воспалению и аутоиммунитету.Наши данные показывают, что Sin функционирует в строме тимуса, регулируя созревание mTECs и, следовательно, их способность устанавливать центральную толерантность. Дефицит Sin привел к рассредоточенной костномозговой архитектуре и уменьшению количества UEA ⁺ MHCII ^hi Aire ⁺ медуллярных эпителиальных клеток. Экспрессия Aire в этой клеточной популяции совпадает с экспрессией разнообразного набора TRA, представленных молекулами MHC на поверхности mTEC, чтобы опосредовать отбор развивающихся Т-клеток.Таким образом, считается, что клетки UEA ⁺ MHCII ^hi Aire ⁺ функционируют как терминально дифференцированные mTEC, необходимые для эффективного отрицательного отбора тимоцитов, которые экспрессируют потенциально аутореактивные TCR. Наши результаты, демонстрирующие снижение количества зрелых mTEC и экспрессии TRA, сопровождающееся неэффективным mTEC-опосредованным элиминацией антиген-специфических Т-клеток у мышей Sin ^{– / –} , показывают Sin как новый регулятор созревания mTEC и опосредованное mTEC установление центральной толерантности. .

Уменьшение общего количества UEA ⁺ MHCII ^hi Aire ⁺ mTEC, снижение экспрессии TRA и / или дефектная архитектура мозгового вещества тимуса – все это может способствовать дефектному отрицательному отбору у мышей Sin ^{– / –} . Поскольку отдельные аутоантигены экспрессируются только в небольшой фракции общих mTEC, состоящих из клеток CD80 ^hi (Derbinski et al., 2008), было предложено, что обширные взаимодействия между mTEC и тимоцитами необходимы для установления центральной толерантности ( Kyewski, Klein, 2006; Mathis and Benoist, 2004).Когда была проанализирована экспрессия TRA во всей популяции TEC, мыши Sin ^{– / –} показали заметно сниженную Aire-зависимую и -независимую экспрессию тканеспецифического антигена, вызванную уменьшением популяции зрелых mTEC. Следовательно, уменьшенное количество mTECs у мышей Sin ^{– / –} , сопровождающееся заметно сниженной Aire-зависимой и -независимой экспрессией TRA, может приводить к снижению вероятности взаимодействия TCR / MHC – mTEC, влияя на эффективность негативной селекции. Дисперсная мозговая структура, отмеченная у мышей Sin ^{– / –} , также может снижать эффективность отрицательного отбора, приводя к негерметичной центральной толерантности.Подобно животным Sin ^{– / –} , мыши LTβR ^{– / –} демонстрируют диспергированную мозговую архитектуру и сниженное общее количество mTEC. Кроме того, экспрессия TRA в популяции зрелых mTEC является нормальной, когда либо LTβR, либо Sin удаляются, но у этих животных развивается возрастной аутоиммунитет (Boehm et al., 2003). Т.о., дефекты в количестве и / или распределении зрелых mTECs, задокументированные в тимусе Sin ^{– / –} , могут значительно нарушить взаимодействие этих клеток со созревающими тимоцитами, приводя к дефектам центральной толерантности.

Дефицит Sin привел к значительному сокращению цикличности клеток UEA ⁺ MHCII ⁺ в стационарных условиях (показано сниженным окрашиванием Ki67 и включением BrdU), что позволяет предположить, что Sin участвует в сигнальных путях, которые влияют на пролиферацию этих клеток. . Для дальнейшего изучения функции Sin в развитии mTEC мы сосредоточили внимание на факторе роста KGF и его рецепторе FGFR2IIIb, поскольку было показано, что эта пара лиганд / рецептор регулирует митогенез и дифференцировку эпителиальных клеток (Finch and Rubin, 2004).Действительно, введение KGF in vivo привело к экспансии mTEC UEA ⁺ и cTEC UEA ^– у мышей дикого типа, которая полностью блокировалась в тимусе Sin ^{– / –} . Ингибирование экспансии cTEC в тимусе Sin ^{– / –} было неожиданным, учитывая низкую экспрессию Sin в cTEC дикого типа и наблюдение, что дефицит Sin не оказывает заметного воздействия на количество и пролиферацию cTEC в стационарных условиях. Возможно, что экспрессия Sin активируется в cTEC в ответ на лечение KGF или что Sin экспрессируется в популяции предшественников, которая дает начало кортикальным и мозговым эпителиальным клеткам.В будущих экспериментах будет важно изучить онтогенез различных популяций TEC с использованием дополнительных поверхностных маркеров в присутствии или отсутствии KGF в тимусе Sin ^{– / –} . Это может помочь нам идентифицировать бипотентные предшественники ТЕС и привести к лучшему пониманию развития различных клонов эпителиальных клеток тимуса и роли Sin в этом процессе.

В настоящее время неясно, как Sin может регулировать передачу сигналов ниже рецептора KGF FGFR2IIIb. Семейство рецепторов FGF состоит из тирозинкиназ, которые регулируют выживаемость клеток и пролиферацию эпителиальных клеток (Finch and Rubin, 2004; de Giorgi et al., 2007). Связывание лиганда фактора роста с FGFR вызывает димеризацию рецептора и трансфосфорилирование, опосредованное тирозинкиназой. Это приводит к активации фосфоинозитид-3 киназы и Akt, а также к активации регулируемых внеклеточными сигналами киназ 1 и 2 (ERK-1/2), двух путей, которые контролируют выживание и пролиферацию клеток, соответственно. Киназы семейства Src также участвуют в передаче сигналов ниже рецепторов FGF путем рекрутирования и фосфорилирования адаптерных белков, участвующих в активации Akt и ERK-1/2 (Bromann et al., 2004; Финч и Рубин, 2004). Поскольку Sin был выделен и идентифицирован как белок, взаимодействующий с киназой семейства Src (Ishino et al., 1995; Alexandropoulos and Baltimore, 1996), мы предполагаем, что активация KGF FGFR2IIIb может вызывать активацию киназ Src, в свою очередь, направляя Sin для фосфорилирования, и создание сайтов связывания для потенциальных промежуточных продуктов передачи сигналов, таких как FRS1a, b и Grb2 / Sos. Было показано, что эти промежуточные продукты передачи сигналов модулируют митогенную активацию посредством каскада передачи сигналов Ras-Erk1 / 2 (Gotoh, 2008).Следовательно, отсутствие Sin может вызывать нарушение сигнальных комплексов и аберрантную передачу сигналов, нарушая митогенную передачу сигналов и подавляя пролиферацию. Попыткам биохимического анализа роли Sin в KGF-опосредованной экспансии mTEC препятствовали технические ограничения, вызванные низким количеством mTEC, присутствующих в каждом тимусе. Кроме того, время, необходимое для выделения mTEC, оказалось недопустимым при анализе событий временного фосфорилирования в ответ на активацию FGFR2 в интактном тимусе.Следовательно, необходимо будет разработать новые методы биохимического анализа для изучения роли Sin ниже рецептора FGFR2IIIb в mTEC, чтобы полностью понять адапторную функцию Sin в митогенезе и конечную роль Sin в установлении центральной толерантности через его влияние на физиология mTEC.

Наконец, хотя мы показали, что дефицит Sin снижает количество mTEC, продукция mTECs не была полностью заблокирована у мышей Sin ^{– / –} , что указывает на то, что множественные сигнальные пути вносят вклад в дифференцировку mTEC.Недавно два члена суперсемейства TNF и их рецепторы, CD40L / CD40 и RANKL / RANK, были вовлечены в регуляцию развития mTEC кооперативным, зависимым от стадии развития способом (Akiyama et al., 2008; Hikosaka et al., 2008; Irla et al., 2008). В одном из этих исследований RANKL, как было показано, способствует увеличению популяции зрелых mTEC посредством прямого межклеточного контакта и опосредованных MHCII-TCR взаимодействий между положительно отобранными тимоцитами CD4 ⁺ и mTECs (Irla et al., 2008).Поскольку популяции предшественников mTEC экспрессируют низкие уровни MHCII, точная природа сигналов, контролирующих созревание mTEC от популяций предшественников MHCII ^lo , остается неясной. В наших исследованиях мы обнаружили, что KGF оказывал сильное влияние на расширение mTEC UEA ⁺ MHCII ^lo , что соответствовало увеличению числа mTEC UEA ⁺ MHCII ^hi . Это наблюдение предполагает, что KGF (и, возможно, другие растворимые факторы) могут оказывать митогенный эффект на более ранних стадиях развития mTEC, влияя на отдельные клеточные субпопуляции независимо от аутоантиген-зависимых взаимодействий и передачи сигналов, опосредованной суперсемейством TNF.Как следствие, Sin может регулировать отдельные сигнальные пути на определенных стадиях дифференцировки и развития mTEC, влияя на пролиферацию, выживаемость и / или дифференцировку mTEC. Будущие исследования будут сосредоточены на потенциальной роли Sin в других сигнальных путях, включая те, которые регулируются членами суперсемейства TNF, чтобы лучше понять роль Sin в дифференцировке mTEC.

Таким образом, наши исследования предоставляют новое понимание роли сигнального белка Sin в физиологии mTEC и центральной толерантности и имеют важное значение для терапевтических вмешательств с использованием KGF.В доклинических исследованиях аллогенной трансплантации BM было показано, что системное введение рекомбинантного человеческого KGF оказывает положительный эффект, предотвращая реакцию трансплантат против хозяина (GVHD; Rossi et al., 2002; Finch and Rubin, 2004; Bruinsma et al., 2007; Kelly et al., 2008; Krenger, Holländer, 2008). Воздействие экзогенного KGF сохраняет архитектурную организацию ТЕС и лимфоидную клеточность и приводит к более эффективному восстановлению периферического компартмента Т-клеток у предварительно кондиционированных реципиентов аллогенных трансплантатов (Rossi et al., 2002; Альпдоган и др., 2006; Seggewiss et al., 2007). На мышиных моделях острой GVHD инъекция KGF подавляет повреждение тимуса независимо от аллореактивных донорских Т-клеток в тимусе и продолжающейся GVHD в других органах-мишенях, таких как кожа, печень и слизистая оболочка кишечника (Rossi et al., 2002). Введение KGF также предотвращает появление репертуара аутореактивных Т-клеток, которые способствуют развитию экспериментальной хронической GVHD (Chen et al., 2007). Механизмы, посредством которых KGF оказывает благоприятное воздействие, в настоящее время неясны.Понимание роли, которую Sin играет в молекулярных механизмах передачи сигналов и экспансии mTEC, даст механистическое понимание способности KGF увеличивать продукцию тимуса. Это, в свою очередь, может помочь оценить потенциальное использование этого фактора в качестве терапевтического средства для лечения клинических осложнений, связанных с трансплантацией костного мозга и / или аутоиммунным заболеванием.

Рост Наташи Королевы. Основные правила диеты для похудения от Натальи Королевы. Какой размер груди у Наташи Королевой

Все женщины нашего мира стремятся выглядеть привлекательно, они постоянно примеряют на себе различные методики похудания, начиная от выполнения многочисленных диет и заканчивая хирургическими вмешательствами, чтобы поддерживать свою фигуру в стройной и подтянутой.Так что знаменитости в этом плане не исключение.

Они еще больше стараются поддерживать свое тело в соответствующей форме, так как постоянно находятся на виду у многочисленной массы поклонников и должны выглядеть просто отлично. Сегодня я расскажу о секретах похудения от Наташи Королевы.

Певица Наталья Королева никогда не отличалась худобой, внимание окружающих часто привлекала ее «округлость» и «выпуклость». Но она признается, что ей, как и многим другим прекрасным представительницам секса, приходится постоянно следить за своей фигурой.Когда ситуация начинает выходить из-под контроля, у актрисы всегда есть чудесный способ избавиться от лишних килограммов.

Она тоже не скрывала своего питания от публики. Но, на этот раз подробно описаны несколько способов похудания, которые она применяла на протяжении разных периодов своей жизни.

Его рост 160 сантиметров, а вес 52 килограмма, но идеальной считается масса 49 – 50 кг. После рождения сына масса ее тела увеличилась на целых пятнадцать килограммов, но она сумела взять себя в руки и почти через год вернулась в свое обычное состояние.

А теперь просто не узнать, она выглядела и вернулась в прежний вид, снова стала стройной и очаровательной красавицей, притягивающей взгляды многих мужчин.

Завистники считают, что Наташа склонна к полноте, а избавиться от лишних килограммов ей удалось только благодаря вмешательству пластических хирургов. Якобы она перенесла много операций, вплоть до липосакции, чтобы вернуть былую форму. Певица решила раскрыть свой секрет, пытаясь поставить точку в распространении этих страшных слухов о ее похудании.

Занималась спортом, бегала ежедневно, но каких бы кардинальных результатов это не дало. Затем она обратилась за помощью к одному очень известному диетологу из Великобритании. Он прописал ей голодать три дня каждый месяц, после чего неделю на овощах, приготовленных на пару. Вроде бы ничего сложного, а результаты просто впечатляющие.

Есть еще один маленький секрет. Если отказаться от соли, то за три недели можно сбросить семь килограммов. Еда, конечно, становится ужасно свежей и безвкусной, особенно тяжело тратить первую неделю, но, но, когда вы действительно начнете сбрасывать лишний вес, вы поймете, что игра действительно стоит свеч.

Для поддержания веса лучше отказаться от приема мучных изделий и макаронных изделий. Предпочтение следует отдавать нежирным и отварным блюдам, приготовленным из различных овощей, морской рыбы и нежирного мяса.

Кушать нужно каждые три часа, а раз в неделю нужно придерживаться особого питания, которое включает только грейпфрут и белок вареного куриного яйца, и их нужно есть каждый час. Наталья так привыкла брать с собой емкости с этими продуктами, что постоянно возила с собой небольшую сумочку с этой провианте, как походную кухню.

Конечно, на одной диете «не выйду», поэтому необходимо регулярно тренироваться в фитнес-центрах или тренажерном зале, пользоваться услугами массажисток, чтобы поддерживать мышцы в тонусе. Поэтому актриса обращает внимание не только на советы специалистов диетологов, но и на активный образ жизни. Она регулярно занимается аэробикой, плаванием, выполняет бег трусцой и таким образом поддерживает форму своего тела.

Что касается процедур по разминанию тела, Наташа рекомендует всем обычный классический массаж, без использования каких-либо масел, так как он наиболее эффективен.Или проработка подкожно – жировой клетчатки с помощью вакуумных баллончиков, на которую тоже очень хорошо влияет общий тонус, но для живота подходит электромизм.

Художник убежден, что любая представительница прекрасного пола обладает достаточной волей и огромным желанием добиться вреда для своего тела. Главное – проявить усилие, а не бросить то, что вы начали делать. Пусть даже поначалу будет немного сложно, но надо греть мысль, что станешь стройным и привлекательным.

Она призналась, что очень любит украинские пельмени, и часто готовит это вкусное блюдо себе и своим домочадцам, и она знает, сколько времени потребуется провести в спортзале, выполняя упражнения, чтобы сжечь полученные калории, и не набирать лишний вес.Она очень неукоснительно за этим следит, и в спорте не дает себе пренебречь.

Заключение

Любая диета подразумевает, что жить ей придется – хоть какое-то, но определенное время, а что дальше, опять лишние килограммы? Поэтому нужно постоянно придерживаться здорового сбалансированного питания, чтобы всегда держать себя в форме, а не запускать свой организм.

Такая поза более правильная, чем повод «сесть» на какую-то диету. Лучше всего пересмотреть образ жизни и ограничить себя употреблением жирных и сладких продуктов в больших количествах и придерживаться этого на протяжении всей жизни.

Не стоит забывать и о спорте, ведь активный образ жизни способствует поддержанию нашего тела в тонусе и подтянутости.

Детство Наташи Королевы

В 7 лет девочка была записана в музыкальную школу по классу фортепиано и параллельно в хореографическую студию имени Григория Веревки. Важным событием, предопределившим судьбу малышки, стало знакомство с композитором Владимиром Фастряковым, взявшим одаренную Наташу под свое крыло.В 12 лет она начала выступать с его песнями («Куда ушел цирк», Мир чудес), так быстро стала звездой всех городских праздников: детских утренников, правительственных съездов, новогодних огней, городских дней – Каждое мероприятие сопровождалось чистым голосом Наташи. В 1987 году девушка стала дипломантом конкурса народной музыки «Золотая чартон».

В том же году Наташа впервые выступила на телевидении в программе «Shirious Circle» (своеобразный прототип шоу «Минута славы»), подарившей славу многим начинающим исполнителям. : Дмитрий Маликов, Леонид Агутин, группа «Секрет»… Но поистине знаковым событием для молодой певицы стало выступление на Конкурсе вокалистов в Евпатории. Призовых мест она не занимала, но внимание Эльвиры обратили на себя ассистенты известного московского телепродюсера Марты Могилевской. Наташа подарила женщине кассету со своим материалом, не зная, что в дальнейшем этот поступок сыграет огромную роль в ее жизни.

Наташа Королева в передаче “Широкий круг” (1986)

Какое-то время, но новости из Москвы не приходили, и Наташа продолжила строить карьеру на родной Украине, поступив в Киевское эстрадно-цирковое училище на по специальности «эстрадный вокал».Летом 1989 года она отправилась в тур по Штатам.

Девушка-рыбалка произвела сильное впечатление на американских учителей вокала, которые предложили ей стать ученицей школы Истраймс при престижном Рочестерском университете. Но Наташа, с которой к тому времени представители Марфы Могилевской, отвергли это заманчивое предложение и отправились покорять Москву.

Кастинг Наташа Королева

Карьерный расцвет Наташи Королевы. “Дельфин и Русалка”

При первой встрече Игорь довольно скептически отнесся к этой проверке: 16-летняя пухленькая «Хохлушка» не походила на эффектную поп-диву, к тому же она шарахалась от певицы, казавшейся ей королем и богом от Музыка. Тем не менее, послушав, он был приятно удивлен и вскоре написал для юного протеже песню «Yellow Tulips», которая стала заглавной песней одноименного альбома, увидевшего свет в 1990 году.На обложке пластинки была надпись: «Наташа Королева поет песни Игоря Николаева».

Наташа Густ превращалась в Королёва достаточно регулярно: псевдоним придумал Николаев, который был уверен, что публика не сможет вспомнить фамилию «Пуст», и звучит она как-то по-плебейски, другое дело – гордо, внушительно. “Королев”.

После выхода альбома популярность Наташи Королевы стала буквально лгать. «Желтые тюльпаны» вывели девушку в финал главного музыкального конкурса страны – «Песни года».«Стадионы и концертные площадки были переполнены, любители дуба несли желтые тюльпаны с любимым артистом, а когда Наташа сломала небольшой тайм-аут, поклонники ее творчества попросили выставить на сцену развевающуюся девушку.

« Песня Год-1990 »: Наташа Королева -« Желтые тюльпаны »

В 1991 году Наташа Королева окончила эстрадно-цирковое училище. В 1992 году свет увидела пластинка« Дельфин и Русалка », а творческий тандем Игоря и Наташи ушел в грандиозный гастрольный тур по городам России с одноименной программой, за следующие три года мы покорили не только отдаленные уголки нашей Родины, но и крупные города США, Израиля и Германии.

В 1994 году певица уже выпустила сольный альбом под названием «Фанат» (музыка и тексты по-прежнему были заслугой Игоря Николаева). Однако ей пришлось завоевать доверие слушателей, которые не хотели верить в конец «дельфинов и русалок» и признать Наташу самостоятельной творческой единицей. Благодаря долгой упорной работе певице удалось вернуть публике локацию. Например, весной 1995 года она провела три благотворительных концерта на Дальнем Востоке в знак поддержки жертв разрушительного землетрясения на Сахалине.

В 1995 году вышел второй исключительно сольный альбом “confetti”, состоящий из одиннадцати песен. Среди них композиция «Маленькая страна», вскоре покорившая эфир федерального телевидения и радио, превратившись в бессмертную шляпу для детей и взрослых, продолжающих верить в сказку.

Наташа Королева – «Маленькая страна»

В это время Наташа Королева дебютировала как актриса в мюзикле «Старые песни о главном», где сыграла дочь председателя и вместе с Ладой, Дэнс и Алена Апина исполнили песню «Вот кто с доски спустился».Спустя время он появился в следующих трех частях музыкального фильма.

В 1997 году Наташа утвердила роль Мальвины в мюзикле «Последние приключения Буратино» (примечательно, что Кристина Орбакайте сыграла самого Пиноккио. В перерывах между съемками Наталья работала над новым материалом, а в декабре того же года поклонники Королева желе приветствовали ее новый альбом – «Бриллианты слез». Многие слушатели отметили, что Наташа сменила и то, и другое. внешне и духовно – не девушка смотрела с обложек на покупателей, а дама вполне устроила.Лирика стала взрослой: «Девушка, мечтающая о большой любви» пришла на смену «маленькой стране».

С новой программой она отправилась в мировое турне, во время которого ей аплодировали залы Лондона, Нью-Йорка, Берлина и Афин, а в 1999 году она отправилась на гастроли вместе с Игорем Николаевым и Концертной программой » Самый родной ».

В 2000 году Королева задумался о своем профильном образовании и поступил на актерский факультет Хитиса, который закончил три года спустя

Новое творчество Наташи Королевы

В 2002 году певец выпустил сборник лучших хитов под названием «Осколки прошлого». В него вошли 14 хитов в стиле Queen, а также новая песня «Еще немного обдумано». «Что со мной сейчас случилось? И жизнь продолжается», – транслировали страну по каждому радио.

Наташа Королева – «Немного более продуманная»

Следующий альбом Наташа Королева записывала вместе со своим новым избранным партнером Сергеем Глушко, также известным под псевдонимом Тарзан. Табличка называлась «Хотите верьте, хотите нет». Спустя три года пара представила еще одну совместную работу под названием «Рай, где ты». Одноименный альбом вышел при поддержке Ювелирного Дома «Хрустальные мечты», лицом которого Наташа была с августа 2006 года.

В 2008 году Наташу пригласили показать шоу «Танцующие звезды», поставив певица в паре с хореографом Евгенией Папунаишвили.За короткое время королеве пришлось выучить множество сложных танцевальных пассов, но усилия были вознаграждены лишь третьими призами.

«Танцы со звездами»: Наташа Королева и Евгений Папунаишвили

А в следующем году Наташа представила свой писательский дебют, во многом автобиографический роман «Мужской стриптиз». На этом эксперименты певицы не прекратились: вскоре она стала владелицей салона красоты, который назывался – «Салон красоты Наташи Королевы».

Летом 2010 года певец вместе с Олегом Газмановым отправился на Фестиваль русской культуры в Германию.Все средства от продажи билетов на концерт звезд перечислялись в Благотворительный фонд Красного Креста. В ноябре 2013 года звезда сообщила о прекращении гастрольной деятельности.

С 2012 по 2014 год Наташа вместе с мамой Людмилой ходят в одно время, вела передачу «Пора обедать» на Первом канале. В рамках шоу сравнивали домашнюю кухню и кухню ресторана – обычные хозяйки бросили вызов профессиональным поварам.

Личная жизнь Наташи Королевы: между дельфином и стриптизером

Знакомые Наташи заметили, что, хотя он отчаянно отрицал это, он тоже влюбился в Николаева: его рот зацепили открытым ртом, скопировали жесты и речевую ману. Они стали жить вместе, но воспитанная в строгости Наташа сразу поставила певицу перед фактом: никакого гражданского брака, только юридические лица: «Я была очень строгими правилами и считала, что все должно быть только после свадьбы.Правда, сейчас передумал – считаю, что надо сначала проверить партнера, а потом выходить за него замуж … Когда я понял, что ухаживания Игоря зашли слишком далеко, я сказал: «Или официально, или как-нибудь». Надо было подумать … ».

Тем не менее, пиарщику музыканту не хотелось, поэтому Наташе пришлось взять все в свои руки и сделать хитрую лошадь. С родителями она приехала домой в Николаев и пригласила В проходе сотрудников нет – никаких фуршетов, пышных нарядов и колец, только штампы в паспорте.

В 2000 году Наташа Королева ушла от супруга. По словам певца, причиной тому стала постоянная измена Николаева. Хотя расставание произошло без скандалов и сцен ревности, оба пережили этот разрыв тяжело.

В попытке отвлечься от давящей раны на сердце Наташа с головой погрузился в работу. Для одного выступления она пригласила команду танцоров «оригинального жанра», проще говоря – стриптизерш. Среди них был светловолосый телеведущий Тарзан, которому пришлось обсуждать с Наташей детали будущей оплаты.

В марте россиянки начинают сходить с ума. В том смысле, что примеряя свои летние джинсы, они приходят к мысли о необходимости срочно похудеть. Часто дамы предпочитают избавляться от лишних килограммов с помощью диет. Насколько они эффективны?

По словам модели Лопьевой, она попробовала «Миллионную диету», но никто с ней «чуда» не совершил. Против такого способа поддержания фигуры выступают певицы Веры Брежневой, Анна Семенович. А Наташа Королева вообще предлагает больше… секс.

Анна Семенович, певица

35 лет, вес – 65 кг, рост – 169 см, объемы – 110 – 60 – 92.

«Путем долгих проб и ошибок я поняла, что самый верный способ похудеть. не меньше, а больше двигаться. Ведь всевозможные диеты могут просто насаждать живот или иммунитет, который был в моей жизни когда-то. Несмотря на то, что я голодала под наблюдением врачей и выглядела достаточно хорошо, тогда у меня было для восстановления иммунной системы ».

Ирина Шейк, Супермодель

29 лет, рост 178 см, рост 88-58-90.

«Я практически не сижу на диетах», – сказал Stylebistro Shake. – Я думаю, что у человека может быть все, что ему нравится, при условии, что он будет регулярно делать упражнения, чтобы поддерживать себя в форме. Не смотря ни на что – можно заниматься на тренажерах, плавать, бегать в парке или заниматься пилатесом. И, конечно же, физические нагрузки должны приносить радость – ведь именно положительные эмоции делают нас красивыми. Лично я обожаю ходить в спортзал! “

Вера Брежнева, певица

33 года, вес – 53 кг, рост – 171 см, объемы – 90 – 62 – 92.

«Никаких диет! Правильное питание: завтрак / обед / ужин, без перекусов, последний прием пищи за 4 часа до сна, занятия спортом».

Анна Седокова, певица

32 года, вес 61 кг, рост – 172 см, объемы – 90 – 61 – 88.

«Чудес на свете нет. А красивое тело без труда не достанется никому. Как ни плохо, задницу подними – в зал. Помните, что ваше тело – это не ведро для мусора, вам не нужно есть, двигаться, вещи там, что придется.Просто делайте зарядку утром и вечером, и через месяц у вас будут результаты лучше, чем у тех, кто все это время лежал на диване. »

Анфиса Чехова, телеведущая, актриса

37 лет, 68 кг, рост 165 см, 100-71-109.

« Кто нас довел до женщин, до такого маразма …. извиняюсь или за каждую “вредную” штуку отталкивать? Кто нам сказал, что это модно? Я всегда восхищался людьми, которые не оправдывают своих поступков! “

Victoria Locking, модель

31 год, вес – 55 кг, рост – 177 см, объемы – 98-64-92.

«Помните, что диета – это временная мера, после которой обязательно срыв. Однажды я попробовал на себе миллион диет, и ни одна из них не сотворила чуда! Только когда вы научитесь слышать свое тело и чувствовать тело, вы можете забыть про диеты и лишний вес, но это происходит не сразу ».

Наташа Королева, певица

41 год, рост – 160 см, вес – 52 кг, объемы – 90 – 60 – 96.

Внешний вид:

«Если у вас нет времени на обычные ежедневные занятия спортом, займитесь регулярным сексом!».

Виктория Боня, модель, телеведущая

35 лет, рост 171 см, вес 61 кг, 82-62-89.

«Хорошая фигура может быть только у того, кто соблюдает правила рационального питания. В принципе, моя фигура не нуждается в диете».

Катя Жаркова, модель размера «плюс»

25 лет , рост 178 см, вес 84 кг, вес 107-82-112 г.

«Никогда не смешивайте свое тело. Возьмите себя таким, какой вы есть, и не позволяйте никому сомневаться в том, что вы прекрасны в том виде, в котором вы есть сейчас!».

Неожиданно для аппетитных форм подошли правительства четырех стран – вслед за Испанией, Италией и Израилем закон, обязывающий модели иметь нормальный вес, принимает Франция, пишет «КП». В нашей стране дело еще не дошло до закона, но споры в Рунете уже кипят. Газету спрашивают: так кто же теперь должен быть законодателем моды, хьюмидист или пампушки?

Наташа Королева (в величии порыва) родилась в Киеве, в музыкальной семье.У Наташи есть старшая сестра Ирина, она тоже певица, выступает в основном в Америке и Канаде. С раннего детства Наташа пела в хоре, затем поступила в музыкальную школу.

Фестиваль в Евпатории существенно повлиял на карьеру Наташи Королевы, после чего музыкальные записи Наташи попадают на музыкальный редактор Центрального телевидения Марш Могилев. Второй важный шаг – представить Игоря Николаева, будущего первого мужа певицы. Эти два знакомства стали причиной стремительного роста популярности молодого певца.

На данный момент в дискографии 10 полноценных альбомов и около 30 синглов. Как и певица Наташа Королева удостоена звания Заслуженная артистка России.

Предлагается небольшое анкетное досье, из которого можно узнать, какой рост и вес у Наташи Королевы, каковы параметры фигуры певицы, а также узнать другую интересную информацию. При подготовке материала частично использовались Википедия и некоторые другие открытые источники. Также предлагаем узнать, какого роста и веса Вера Брежнева – еще одна популярная певица украинского происхождения.

Какое настоящее имя Наташа Королева

Настоящее имя (ФИО) Наташа Королева – Наталья Владимировна Пусть. Написание на украинском языке – Наталья Володимирівна Подобрать.

Когда родилась Наташа Королева?

Какой возраст у Наташи Королевой?

На момент написания статьи (декабрь 2018 г.) Наташе Королеве 45 лет.

Какой знак зодиака Наташа Королева?

Наташа Королева Знак зодиака – близнецы. Родился в год синего водяного быка по восточному гороскопу.

Где родилась Наташа Королева?

Наташа Королева родилась в Украинской ССР (Украина), город Киев.

Что такое Наташа Королева?

Рост Наташи Королевой 160 сантиметров. Привлечение информационного фильма портала. Некоторые источники утверждают, что рост Наташи Королевы всего 155 сантиметров и даже фото, на которых певица стоит рядом с другими людьми.

Что такое Наташа Королева?

Вес Наташи Королевой 53 килограмма.Наташа Королева говорит о своем весе: «Я прекрасно знаю, что находится на полноте. Я нашла необычный способ заниматься спортом – не хожу в спортзал, а занимаюсь дома – ко мне приходит личный тренер. человек приходит ко мне специально, чтобы работать со мной, я не могу позволить себе лениться ».

Какие глаза у Наташи Королевой?

Цвет глаз Наташи Королевой – голубой.

Какого цвета на самом деле Наташа Королева?

Этот (натуральный, натуральный) цвет волос певицы Наташи Королевой – светло-русый.

Какого цвета Наташа Королева?

Наташа Королева расцветка – мягкая весна.

Какие параметры фигуры у Наташи Королевой?

Наташа Королева Параметры фигуры: 98-67-94 (Грудь-Талия-Бедра). Данные 2018 из интервью певца. Тогда про свои параметры фигуры Наташа Королева сказала следующее: «При моем росте в 160 сантиметров я считаю идеальным для себя вес 50 килограммов. Чтобы параметры фигуры не выбивались из нормы, посоветовались. с очень известным диетологом – Мариной Королевой (Примечание – Singer Single Family).Диета длится девять дней и позволяет безболезненно изменить фигуру до неузнаваемости. Суть заключается в том, что эти девять дней разделены на равные периоды, в течение которых я использую только один вид продукции. «

Что такое Наташа Королева?

Размер стопы Наташи Королевой – 37-й.

Какой размер груди у Наташи Королевой?

Наташа Королева размер груди – 3-й. В некоторых источниках утверждается, что размер бюста певицы – 4-й, но в основном такая информация появилась после того, как Наташа Королева во время беременности набрала несколько килограмм.Теперь певица снова в форме и бюсте вернулась к прежним размерам.

Наташа Королева Проигрывает с полной самоотдачей, а также поет …
«Мое тело имеет свойство накапливать воду.

Так что мне не нужно худеть, мне нужно р появиться . Вода из ткани уходит, и все говорят: “Королева похудела!”

Сейчас при росте 160 см Наташа Королева весит 52 кг. Но идеально смотрится, когда стрелка на весах показывает цифру «49».К 28 годам поправилась до 51 кг, затем были беременность и роды. Дали плюс 15 кг, а потом на целый год избавилась от этих килограммов.

Сначала Наташа занималась спортом, бегала. Отличного результата не добилась, поэтому обратилась к диетологу – специалисту из Лондона. Он придумал Наташу Королеву Диету. У нее 3 дня в месяце ничего не было …

Сегодня Наташа Занимается в фитнес-клубе Аэробикой, бегает на беговой дорожке, плавает.

Высота 160 см
Вес 52 кг

«Два года назад я обратился к своей фамилии – Маргарита Королева. Она очень известна в среде художников и политиков, поэтому я решил с ней познакомиться. Дело не в том, чтобы похудеть – мне просто нужно было« убрать »килограмм. из 2-3. И она сказала то же самое:

«Худеть не нужно, но если ты хочешь знать, как ты выглядишь в идеальном весе …» Конечно хочу! Я узнал. Результат потрясающий! Я смотрел на себя в зеркало и удивлялся и радовался.Сколько могут сделать для нас женщины правильное питание и процедуры! Только питание и процедуры – даже без спорта! «

Салатная диета – Оптимальный вариант «сушки» тела (за три недели). Лишние килограммы от такой диеты бегут на бег. Наташа советует все попробовать: «Она действительно работает!»

Для начинающих K. perfect forms также рекомендует сменить режим питания и питания. Нет макарон, муки. Больше мяса, рыбы, овощей и есть надо каждые 2 часа.

« Раз в неделю советую проводить разгрузочный день – тоже отличное дело, сама убедилась в его эффективности. Такой разгрузочный день: съесть грейпфрут, через час – протеин вареного куриного яйца, через час – снова грейпфрут, и так весь день грейпфрут и протеин через час. Организовать такое питание несложно. Наслаждайтесь грейпфрутами и белками в контейнерах и берите с собой. «

Наташа Королева избавилась от валика на животе с помощью электростимуляции .По ее словам, эта процедура очень эффективна и помогает подтянуть ягодицы.

Еще Наташа любит ручной массаж И не приветствует обертывания: «А приятные процедуры, такие как обертывание, я, наоборот, не очень люблю. Хотя для питания кожи они полезны. Ну, могу. не лежать как в коконе, это не в моем характере »

На «Прекрасном» Наташа тратит 1,5 часа в неделю.

Самые толстые знаменитости и их жены.Самые известные отцы мира (50 фото) Толстая актриса

Невероятные факты

Каждому из нас хоть раз доводилось видеть шикарную жизнь знаменитостей, которые могут позволить себе все и даже больше. Однако каждый из нас также понимает, что все совсем не так, как кажется на первый взгляд.

Знаменитости всегда находятся под прицелом фотоаппаратов, и зачастую обычные вещи им не по карману, потому что сразу всем представят, и они начнут их покупать.Мало кто решится на поход в магазин в любимом домашнем костюме, но некоторые не прочь насладиться пренебрежением по ночам.

Сегодня мы поговорим о знаменитостях, которые в определенный период своей жизни сильно набрали вес. Кто-то сделал это ради роли, у кого-то была жизненная проблема, а кто-то просто слишком много ест. Некоторые из участников этой выборки уже привели себя в порядок, о лишних килограммах мы говорим как об определенном периоде их жизни.

толстые знаменитости

1.Джон Траволта

Невероятный мужчина, покоривший сердца женщин всего мира, отразил немного больше. Однако не все потеряно, нужно просто брать для себя.

2. Кэти Перри.

Поклонникам певицы стоило только привыкнуть к некоторой странности в образе и внешности Кэти, она решила удивить поклонников несколькими лишними килограммами.Главное – не увлекаться.

3. Нелли Фуртадо

Почему такая горячая красотка была похожа на такую ​​пышку? Говорят, что всему виной развод певицы.

4. Рианна

Рианна никогда не была плохой, но на фото форма очень пышная.Поклонников ее таланта это возмутило.

5. Кристиан Бэйл

Этот замечательный актер прибавляет в весе, он очень худой. Все для ролей. Нет на него времени.

6. Ева Лонгория

Ева слегка расслабилась, но ей не о чем беспокоиться, так как ее пышные формы очень нравятся ее мужу.

7. Джулия Робертс

Юлия набрала 20 лишних килограммов после развода с мужем.

8. Айшвария Парадайз

После того, как эта индийская красавица родила дочку, этого просто не узнать.Но, по слухам, своим внешним видом вполне доволен.

9. Келли Кларксон

Звезда после рождения двоих детей стала тяжелее на 20 кг.

10. Вал Килмер

Этот мужчина в свое время был эталоном сексуальности в Голливуде, но сейчас так много не назовешь.В СМИ регулярно ищут информацию о якобы тяжелом заболевании, но актер опровергает все слухи.

Плоские знаменитости

11. Бритни Спирс.

На заре карьеры Бритни была очень худой и мускулистой и при любой возможности открывала живот. После рождения двоих детей и развода с Кевином Федерлайном она не оставила привычки сжимать живот, справедливо эффект был уже немного неправильный.

12. Алек Болдуин

Алеку Болдуин Папарацци чаще фотографируют с едой. Сегодня его некогда очень напряженное лицо стало просто круглым.

13. Джанет Джексон

Всем известная сестра поп-короля личность всегда была заметна и в прямом, и в переносном смысле. На заре карьеры Джанет была очень стройной, но в какой-то момент, когда карьера певицы пошла на спад, она набрала много ненужных килограммов.Сегодня Джанет редко появляется на публике.

14. Стивен Сигал

Звезда боевиков 90-х сегодня практически сошла с экранов и стала как тяжеловес. Во многих интервью Стивен много оправдывается своей физической формой. Запаха визуальной любви, конечно, хватит надолго, но все же …

15. Джессика Симпсон

Эта очень амбициозная девушка сделала успешную карьеру в разных сферах: она певица, актриса и телеведущая.Однако в определенный момент она начала быстро набирать вес. Поклонники винила в этом жестком расстаются с излюбленным на то время никнеймом.

Плоские звезды

16. Райан Гослинг

Райан в отличной форме: у него подтянутое тело, и он отлично держит себя. Но однажды, в начале карьеры, Райан отказал режиссеру Питеру Джексону из-за того, что актер набрал слишком много лишних килограммов.В результате, по словам самого статуи, он остался толстым и безработным.

17. Кристина Агилера

Был период “пушистости” и у знаменитых агилеров. Он совпал с ее разводом. Имея лишние килограммы, Кристина встретила своего второго мужа, родила второго ребенка и снова привела себя в форму. Она стала выглядеть даже лучше, чем он сам.

18.Винс фон

Какие-то лишние килограммы у актера были всегда. Но в таком виде смотрится очень гармонично. Поклонники приняли Винса без осуждения, а образ худощавого победил, время начала карьеры, а летом ушел вовсе. Да и сам актер над этим совершенно не работает.

19. Мэрайя Кэри

Хорошего человека должно быть много.Но, к сожалению, не всегда успех продолжает сопровождать приход лишних килограммов. Сегодня Марьяй выглядит более уставшей, а интересные альбомы давно не выпускаются.

20. Лоуренс Фишборн

Сегодня не узнать мудрого морфуса из “матрицы”. Избыточный вес на лице. Несмотря на то, что у актера широкая кость, все же ему нужно потрудиться, чтобы соответствовать планке супергероя.

Толстые звезды

21. Рассел Кроу.

Еще один звездный красавчик, который немного раскрутился. Однако даже с лишним весом актер вовсе не переставал появляться на экранах: тоже успешно проходит кастинги и как будто не собиралась худеть. Более того, в то время спокойная супружеская жизнь с двумя детьми сделала его еще счастливее, и он совсем не выглядел несчастным или живым.

22. Мэтт Дэймон.

Мэтт – любимый многими актер. Сейчас ваш красавец в отличной форме, но было время, когда в 2009 году произошло удивительное преображение. Актер сильно забил, отразил и закрасил волосы, усы. Все это произошло ради роли в фильме «Информатор».

Когда стрелка на весах достигает своего предела, это не значит, что за карьеру в шоу-бизнесе можно поставить жир как пятую точку жира, крестик.
Мы собрали десять представителей российской и мировой фабрики грез, которые благодаря лишним килограммам только уверенно стоят на звездном пьедестале.
Мариам Мерабова (российская певица) 42 года
«Хорошего человека должно быть много», – прошли администраторы проекта «Голос», обсуждая участницу Мариам Мерабову. Бывший бэк-вокалист Дима Билан на проекте полюбил все и сразу – за непринужденный стиль общения, искренность и настоящий талант.Пышные формы не помешали певице дойти до финала популярного проекта, во время которого она поддержала любящего супруга и трех дочерей. Помимо прочего, Мирабова преподает в престижной музыкальной школе другой дамы с аппетитными формами – Аллы Пугачевой.

Певица Мариам Мирабова
Адель (британская певица)
26 лет
Несмотря на то, что Кутюрье Карл Лагерфельд посоветовал британской певице сбросить явно ненужные килограммы, девушка не спешила записываться на прием к диетологу, а готовились следующие хиты.Выпустив всего два альбома, в 2012 году певица забрала шесть статуэток с премии Грэмми. В конце того же года Адель родила сына, поэтому ее формы только прибавили в объеме.

Певица Адель
Анна Нетребко (российская оперная певица)
43 года
Зимой прошлого года более трех миллиардов человек смотрели с голубыми экранами, как оперная дива Анна Нетребко исполняет гимн Олимпийских игр в Сочи. Нежно-голубое платье с трудом скрывало круглую фигуру воспитанников маэстро Валерия Гергиева.Среди известных оперных ныряльщиков есть лишний вес – это обычная тенденция, и некоторые специалисты считают, что благодаря впечатляющему комплексу голос звучит намного красочнее.

Оперная певица Анна Нетребко
Ребел Уилсон (австралийская актриса)
28 лет
Звезда «Постельной вечеринки в Вегасе» и «холостяки» могут серьезно потерять работу, если она остановится после шести вечера. Голливудские режиссеры выстроены в очередь, чтобы приглашать детей на роль новой остроумной толстушки, с которой актриса блестяще справится.

Актриса Рабл Уилсон
Маша Федорова (главный редактор Glamour)
43 года
Маша Федорова, пожалуй, самая массовая единица светской Москвы. Великолепная дама – желанная гостья на всех вечеринках столичных модников и олигархов. Женщина – эталон стиля не только для дам с биркой XXL на воротнике, но и для стройных светских дам и звезд, бегущих за модными советами в редакцию популярного женского журнала.

Главный редактор Glamour Маша Федорова
OPRA WINFRI (американская телеведущая и медиасигнал)
60 лет
Журнал Forbes оценивает состояние опрача на 2.8 миллиардов долларов, что позволяет ей называться самой богатой женщиной мирового шоу-бизнеса. Автор и ведущая проекта «Шоу Опры Уинфри», родилась в неблагополучной семье, была изнасилована в 9 лет, а 14 пережила смерть собственного ребенка. Взять невероятный успех Опре удалось, несмотря на отсутствие диетолога и режима питания. После того, как телеведущая набрала лишние килограммы, блогеры стали признаваться друг другу на форумах, что с аппетитным комплексом Опра смотрится намного харизматично.

Телеведущая Опра Уинфри
Екатерина Зулкина (российская актриса)
38 лет
Екатерина Зулкина выходила из-под контроля, сколько раз из-за ее искрометного юмора бросалась от смеха член жюри КВН Юлия Гусман. Воспитанник клуба веселый и находчивый – один из самых успешных подопечных Александра Маслякова. Благодаря нестандартной фигуре и таким искрометным шуткам веселые анекдоты получаются еще смешнее. Звезда шоу Comedy Woman и ведущая «Канала» часто радует юмором своих подписчиков в «Инстаграм».Итак, актриса до слез преследовала всех своих читателей, поднявшись в ораторское искусство киевского градуалиста Виталия Кличко.

Актриса Екатерина Зулькина
Октавия Спенсер (американская актриса)
44 года
Американские блогеры обожают Октавию не только за ее актерские таланты, но и за безупречные выходы. Звезда Оскароне из фильма «Соблазнитель» известна изысканным вкусом и чувством стиля. Несмотря на не откровенно внушительный вес, Спенсер всегда выглядит после своего внешнего вида, все модные критики относят ее к модной толстушке.

Мелисса Маккарти (американская актриса)
44 года
Уста оскароносных звезд фильмов «Ночь в Вегасе», «Поймай Толстуху, если сможешь» и «Менты в юбках» редко держатся на замке: актриса или гамбургеры вне ажиотажа фотографов, или демонстрируют очаровательную голливудскую улыбку, когда она появляется на публике. Мелисса настолько востребованный персонаж в мире кино, что даже будучи беременной на большом сроке, она продолжила съемки в телесериале «Девочки Гилмор», где ребенка тоже ждал сценарий.

Актриса Мелисса Маккарти
Корнелия Манго (российская певица)
28 лет
Невозможно было пройти мимо включенного телевизора, когда юная Корнелия Манго появилась на проекте «Фабрика звезд». Внимание публики молодой артист приковал не только за счет экзотической внешности, но и особого вокала и аппетитной фигуры. Несмотря на то, что Корнелия ни разу не доходила до финала Final Factory, с тех пор прибавляет не только в весе, но и в популярности.

Когда стрелка на весах достигает своего предела, это не значит, что за карьеру в шоу-бизнесе можно поставить жир как пятую точку жира, крестик. Супер собрал десять представителей российской и мировой фабрики грез, которые благодаря лишним килограммам только уверенно стоят на звездном пьедестале.

Мерабова Мариам (российская певица)

42 года

«Хорошего человека должно быть много», – прошли администраторы проекта «Голос», обсуждая участника Маира Марабова.Бывший бэк-вокалист Дима Билан на проекте полюбил все и сразу – за непринужденный стиль общения, искренность и настоящий талант. Пышные формы не помешали певице дойти до финала популярного проекта, во время которого она поддержала любящего супруга и трех дочерей. Помимо прочего, Мирабова преподает в престижной музыкальной школе другой дамы с аппетитными формами – Аллы Пугачевой.

Адель (британская певица)

26 лет

Несмотря на то, что Кутюрье Карл Лагерфельд посоветовал британской певице сбросить явно ненужные килограммы, девушка не спешила записываться на прием к диетологу, и готовились следующие хиты.Выпустив всего два альбома, в 2012 году певица забрала шесть статуэток с премии Грэмми. В конце того же года Адель родила сына, поэтому ее формы только прибавили в объеме.

Нетребко Анна (российская оперная певица)

43 года

Зимой прошлого года более трех миллиардов человек с голубыми экранами смотрели, как оперная дива Анна Нетребко исполняет гимн Олимпийских игр в Сочи. Нежно-голубое платье с трудом скрывало круглую фигуру воспитанников маэстро Валерия Гергиева.Среди известных оперных ныряльщиков есть лишний вес – это обычная тенденция, и некоторые специалисты считают, что благодаря впечатляющему комплексу голос звучит намного красочнее.

Ребел Уилсон (австралийская актриса)

28 лет

Звезда «Постельной вечеринки в Вегасе» и «холостяков» могут серьезно потерять работу, если остановятся после шести вечера. Голливудские режиссеры выстроены в очередь, чтобы приглашать детей на роль новой остроумной толстушки, с которой актриса блестяще справится.

Маша Федорова (Главный редактор Glamour)

43 года

Маша Федорова, пожалуй, самая габаритная единица светской Москвы. Великолепная дама – желанная гостья на всех вечеринках столичных модников и олигархов. Женщина – эталон стиля не только для дам с биркой XXL на воротнике, но и для стройных светских дам и звезд, бегущих за модными советами в редакцию популярного женского журнала.

Опра Уинфри (американская телеведущая и медиасигнал)

60 лет

Журнал Forbes оценивает состояние опрача в 2 балла.8 миллиардов долларов, что позволяет ей называться самой богатой женщиной мирового шоу-бизнеса. Автор и ведущая проекта «Шоу Опры Уинфри», родилась в неблагополучной семье, была изнасилована в 9 лет, а 14 пережила смерть собственного ребенка. Взять невероятный успех Опре удалось, несмотря на отсутствие диетолога и режима питания. После того, как телеведущая набрала лишние килограммы, блогеры стали признаваться друг другу на форумах, что с аппетитным комплексом Опра смотрится намного харизматично.

Екатерина Зулькина (российская актриса)

38 лет

Екатерина Зулкина выходила со счета, сколько раз из-за ее искрометного юмора член жюри КВН Юлия Гусман бросалась от смеха. Воспитанник клуба веселый и находчивый – один из самых успешных подопечных Александра Маслякова. Благодаря нестандартной фигуре и таким искрометным шуткам веселые анекдоты получаются еще смешнее. Звезда шоу Comedy Woman и ведущая «Канала» часто радует юмором своих подписчиков в «Инстаграм».Итак, актриса до слез преследовала всех своих читателей, поднявшись в ораторское искусство киевского градуалиста Виталия Кличко.

Октавия Спенсер (американская актриса)

44 года

Американские блогеры обожают Октавию не только за ее актерские таланты, но и за безупречную репутацию. Звезда Оскароне из фильма «Соблазнитель» известна изысканным вкусом и чувством стиля. Несмотря на не откровенно внушительный вес, Спенсер всегда выглядит после своего внешнего вида, все модные критики относят ее к модной толстушке.

Мелисса Маккарти (американская актриса)

44 года

Уста оскароносных звезд фильмов «Ночь в Вегасе», «Поймай Толстуху, если сможешь» и «Полицейские в юбках» редко держатся за замок: актрисы или гамбургеры вне нахлестов фотографов, или демонстрируют очаровательная голливудская улыбка, когда она появляется на публике. Мелисса настолько востребованный персонаж в мире кино, что даже будучи беременной на большом сроке, она продолжила съемки в телесериале «Девочки Гилмор», где ребенка тоже ждал сценарий.

Корнелия Манго (Российская певица)

28 лет

Невозможно было пройти мимо включенного телевизора, когда юная Корнелия Манго появилась на проекте «Фабрика звезд». Внимание публики молодой артист приковал не только за счет экзотической внешности, но и особого вокала и аппетитной фигуры. Несмотря на то, что Корнелия ни разу не доходила до финала Final Factory, с тех пор прибавляет не только в весе, но и в популярности.

В новом фильме «Парни в сундуках», основанном на реальных событиях, одну из главных ролей исполнил самый популярный современный комедийный актер – Джон Хилл. Парой стал Майлз Теллер, оба актера появятся в образах приятелей, которым удалось заключить контракт с Пентагоном на поставку оружия. Кстати, для поклонников Джона Хилла этот фильм вполне ожидаемый, одно лишь его появление на экранах вызывает бурный восторг у женской части зрителей. И это при том, что у актера совершенно нет модельной внешности.Сегодня мы расскажем о десяти самых очаровательных отцах Голливуда, добившихся популярности вне зависимости от веса.

Джон Хилл

Американский актер получил известность и обожание поклонников после выхода на экраны фильмов «Суперперсианцы» и «Побег из Вегаса». Далее, самые яркие работы – это картины: «Мачо и Ботан», «Человек, который все изменил» и «Волк с Уолл-стрит». Очарование Джона Хилла сложно переоценить. Наряду с актерским талантом это качество принесло ему две номинации на престижную премию «Оскар» за роли в фильмах «Человек, который все изменил» и «Волк с Уолл-стрит».Однако и до своей популярности Джон был другим, но актера это не смутило. Однако с годами Хилл стала изрядно прибавлять в весе, что особенно заметили поклонники звезды Голливуда, внимательно следящие за жизнью любимого кумира. Но мы признаем, что лишние килограммы не портят Хилла, и с ролями актер справляется блестяще.

Дэнни де Вито

Легендарный американский актер Дэнни де Вито начал свой путь в киноиндустрии довольно необычным путем: после окончания парикмахерской Академии.Однако отсутствие актерского мастерства никак не сказывается на успехе и наличии актерского таланта. Известность пришла к де Вито после роли в сериале «Такси», отмеченной Золотым глобусом и Эмми. А настоящую славу и армию поклонников актеру обеспечил фильм «Роман с камнем». Симпатия Дэнни, мягко говоря, не обладающего стандартной красотой, буквально не была наказанием со стороны женщин. И это при полноте и небольшом росте. Как легко добиться того, чтобы одного мужского обаяния и харизмы хватило настолько, что женщины перестают обращать внимание на какие-то недостатки во внешности.

Кевин Джеймс.

Кевин Джеймс – один из самых популярных американских актеров и любимец публики. Большинство из которых он покорил своими ролями в таких фильмах, как «Одноклассники», «Правила удаления: Метод Хитча», «Чак и Ларри: Огненная свадьба». Кстати, Кевин тоже талантливый комик, карьеру в шоу-бизнесе он начал с комедийного шоу. И у меня это получилось довольно успешно, поэтому человек был известен определенной части публики еще до своего дебюта в кино. Кстати, на счету Джеймса работа в известном сериале «Король королев», за который актер был номинирован на статуэтку «Эмми».Однако сейчас, параллельно со съемками в фильмах, Кевин является создателем собственного стенда-АПА. Похоже, Джеймс настоящий везунчик, ему одинаково повезло и в профессии, и в личной жизни: актер примерный семьянин, вместе с женой растит четверых детей.

Джон Гудман

Широкая публика добродушная и симпатичная Джон Гудман известен благодаря ролям в фильмах «Король Ральф», «Большой Лебовский» и «Мальчишник: Часть III». Кроме того, голосом Гоудмана говорит всем известная Монстр Салли из популярного мультфильма Monster Corporation.Однако путь к успеху человека начался с детства: будучи школьником, Гудман играл в спектаклях. Поэтому неудивительно, что Джон посвятил свое образование актерскому мастерству. Кстати, театральную сцену актер не бросал: на его счету множество крупных спектаклей, которые имели грандиозный успех и высоко оценены критиками.

Джек Блэк

Пожалуй, это один из самых известных комедийных актеров современности. Джек Блэк, будучи далеко не стройным мужчиной, сумел собрать целую армию поклонников, большая часть которых составляет женскую аудиторию.Однако глядя на мордашку этого симпатичного толстяка, невозможно не поддаться очарованию столь очаровательного мужчину. Зрителям Актер наиболее известен своими ролями в таких фильмах, как «Любовь зла», «Школа обмена», «Школа рока», «Ужасы». Мы уверены, Харизма Джека помогла ему добиться успеха в шоу-бизнесе. Кстати, параллельно со съемками в кино Блэк активно занимается музыкой.

Кевин Смит

Имя еще одного забавного толстяка Кевина Смита знакомо всем поклонникам фильмов «Догма», «Молчаливый Боб» и немого боба.«Именно он сделал постановщиком эти картины, которые одни из зрителей встретили с огромным восторгом, а другие жестко критиковали неоднозначный сюжет. Однако слава Смита не повлияла на славу, а даже наоборот, Впечатляющий толчок дала его карьера. Помимо этих двух нашумевших фильмов на счет режиссера, картина «Клерк». Кстати, этот фильм полностью создавался на деньги режиссера, который пригласил своих друзей на роль Кевин известен тем, что часто приглашает в свои фильмы постоянных актеров, например Бен Аффлек, Джейсон Ли, Мэтт Дэймон снимался в нескольких режиссерских фильмах.

Энтони Андерсон

Энтони Андерсон хоть и имеет внушительные габариты, но выглядит довольно добродушно. Актер известен зрителям по ролям в таких фильмах, как «Очень страшное кино – 3», «Из-за травм», «Дом большой мамочки», «Я, снова я Ирэн», «Джекпот кенгуру», Справедливость и движение »и др. Рисунки. Андерсон органично смотрится в комедийных ролях, за что неоднократно номинировался на различные престижные кинопроизводства. Однако серьезные роли также не проходят незамеченными.Так, за роль в фильме «Отступники» Энтони получил номинацию на премию Гильдии киноактеров США.

Звезды стараются выглядеть презентабельно, но это удается далеко не каждому. Артисты из России и Голливуда часто страдают из-за лишнего веса. Тем не менее это не мешает популярности толстых звезд, а наоборот, привлекает к себе еще больше внимания. Десять звезд с лишним весом – в материале.

Лолита Милявская

По официальной информации, российская певица весит 73 кг при росте 173 см, но поклонники подозревают, что эта цифра устарела.Звезда выглядела великолепно, но со временем набрала много лишних килограммов.

В 2016 году ее фото с фестиваля «Жара» в Баку, где она позирует рядом с и. Сейчас вес артистки неизвестен, но поклонники отмечают, что звезда полностью летает, а вот похудеть она не стремится.

Ева Польна

Евгений Осин

Толстым стал и советский и российский музыкант. Мужчина заметно изменился с 90-х годов. Несмотря на то, что певец вегетарианец, это не помешало ему набрать лишние килограммы.К тому же из-за алкоголя известная певица стала неузнаваемой. Фото артиста до и после шокируют поклонников.

Жасмин

Ольга Будина

В 2015 году актриса появилась на премьере мюзикла «Поют под дождем». Папарацци заметили, что Будин значительно покачнулся. Создатели светских хроник позже отмечали, что даже длинное черное платье и пальто не скрывали недостатков фигуры художника. Нормальный вес звезды – 51 кг, но в указанный период ее вес достиг 84 кг.

DOI: 10.1530 / ERC-15-0086

% PDF-1.3 % 1 0 объект > эндобдж 9 0 объект > эндобдж 2 0 obj > эндобдж 3 0 obj > эндобдж 4 0 obj > транслировать Acrobat Distiller 7.0 (Windows) 3B2 Total Publishing System 8.07q / W2015-10-27T15: 13: 45 + 05: 302015-10-27T15: 13: 45 + 05: 30application / pdf

Стабилизация первичных ресничек снижает повторный вход в абортивный клеточный цикл для защиты поврежденных нейронов ЦНС взрослых от апоптоза

Abstract

Повторный вход апоптотических нейронов в результате абортивного клеточного цикла (АСС) – это недавно охарактеризованный феномен, который возникает после повреждения центральной нервной системы (ЦНС) или в течение заболевания ЦНС.Следовательно, ингибирование прогрессирования клеточного цикла является нейропротекторным в многочисленных моделях патологии ЦНС. Первичные реснички представляют собой повсеместные клеточные органеллы на основе центриолей, которые предотвращают круговорот клеток, но их способность модулировать абортивный клеточный цикл не описана. Здесь мы показываем, что реснички нейронов удаляются in vitro и in vivo после повреждения гипоксией или перерезкой зрительного нерва (ONT), соответственно. Кроме того, принудительная резорбция ресничек сенсибилизировала нейроны к этим повреждениям и усиливала гибель клеток.Напротив, фармакологическое ингибирование или нокдаун shRNA белков, которые разбирают реснички, увеличивают выживаемость нейронов и снижают фосфорилирование ретинобластомы (Rb), главного переключателя для повторного входа в клеточный цикл. Наши результаты показывают, что стабилизация нейрональных первичных ресничек подавляет, по крайней мере временно, цикл апоптотических клеток, что имеет значение для будущих терапевтических стратегий, которые останавливают или замедляют прогрессирование нейродегенеративных заболеваний и острых повреждений ЦНС.

Образец цитирования: Choi BKA, D’Onofrio PM, Shabanzadeh AP, Koeberle PD (2019) Стабилизация первичных ресничек снижает повторное включение абортивного клеточного цикла для защиты поврежденных нейронов ЦНС взрослых от апоптоза.PLoS ONE 14 (8): e0220056. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220056

Редактор: Рафаэль Линден, Федеральный университет Рио-де-Жанейро, БРАЗИЛИЯ

Поступила: 22 января 2019 г .; Одобрена: 8 июля 2019 г .; Опубликовано: 1 августа 2019 г.

Авторские права: © 2019 Choi et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные доступны по Dryad в DOI: 10.5061 / dryad.7dk08bc.

Финансирование: Это исследование было поддержано Операционным грантом Канадских институтов исследований в области здравоохранения (MOP 119309 для PDK) и Отделением анатомии Университета Торонто, финансированием Департамента хирургии, предоставленным PDK. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Фатальное повторное включение нейронов в клеточный цикл, известное как абортивный клеточный цикл (АСС), наблюдалось при ряде заболеваний ЦНС, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона [1,2] или инсульта [3] черепно-мозговая травма (ЧМТ) [4]. Поврежденные нейроны демонстрируют репликацию ДНК и повышение маркеров клеточного цикла, таких как фосфорилированная ретинобластома (pRb) [5]. Ингибирование прогрессирования клеточного цикла с помощью ингибиторов циклинзависимой киназы (CDK) или нокаутом факторов митотической транскрипции было нейропротекторным в ряде моделей повреждения ЦНС, указывая на то, что ACC является критическим процессом в апоптозе нейронов [5-8].

Первичные реснички представляют собой одиночные проекции тела клетки, которые подавляют клеточный цикл за счет секвестрации центриолей на клеточной мембране [9,10]. Каждая эукариотическая клетка имеет две центриоли (мать и дочь), которые связаны вместе, образуя центросому [11]. Реснички имеют основу микротрубочек (аксонему), прикрепленную к модифицированной материнской центриоле, называемой базальным телом [9]. При входе в клеточный цикл аксонема разбирается, чтобы освободить центросому для деления клетки. Это происходит за счет активности гистондеацетилазы 6 (HDAC6), которая деацетилирует тубулин аксонема [12].HDAC6 фосфорилируется киназой Aurora A (AurA), которая сама активируется усилителем филаментации 1 человека (HEF1) и трихоплейном (TCHP) [12,13]. Более того, Polo-like kinase 1 (PLK1) стабилизирует HEF1 [14] и активирует HDAC6 [15] и член семейства Kinesin 2a (Kif2a) [16]. Kif2a ассоциирует с базальным тельцем, чтобы способствовать деполимеризации цитоплазматических микротрубочек [16], тогда как NudE homolog 1 (NDE1) помогает в ретракции ресничек за счет секвестрирования dynein. Динеин регулирует внутрижладжеллярный транспорт (IFT), который необходим для сборки и поддержания ресничек [17,18].Характерно, что быстро делящиеся клетки имеют пониженную частоту появления ресничек и повышенные уровни белков разборки ресничек [19,20]. Напротив, подавление белков разборки ресничек усиливает цилиогенез и ингибирует пролиферацию [17,21,22]. Поскольку реснички почти повсеместны в нейронах и действуют как тормоз клеточного цикла, мы стремились исследовать, играет ли целостность ресничек роль в ACC и может ли ею манипулировать, чтобы остановить ее прогрессирование.

Здесь мы сообщаем, что повреждение нейрона ЦНС взрослого человека приводит к укорочению и потере первичных ресничек.Более того, стабилизация первичных ресничек за счет ингибирования механизмов разборки является нейропротекторной и снижает повторное вхождение в клеточный цикл. Напротив, усечение ресничек путем фармакологического ингибирования или нокдауна компонентов IFT усиливает апоптоз нейронов после повреждения. Эти находки устанавливают новую роль первичных ресничек в регуляции повторного входа в клеточный цикл и сопутствующего апоптоза в зрелых нейронах ЦНС млекопитающих.

Материалы и методы

Комитет по уходу за животными Университета Торонто одобрил это исследование.Номера протоколов: 20011691, 2001699. Животных (крысы Sprague Dawley) анестезировали изофлуораном.

Первичные нейроны коры

Первичные нейроны коры были выделены из крыс P1 Sprague Dawley. Детенышей полностью анестезировали в камере с 4% изофлураном, чтобы уменьшить страдания, прежде чем они были умерщвлены декапитацией большими хирургическими ножницами. Кортикальный слой был рассечен и освобожден от мозговых оболочек в ледяном сбалансированном солевом растворе Хэнка, не содержащем кальция и магния, и диссоциирован в 0.05% трипсина в течение 15 минут при 37 ° C. Трипсинизацию прекращали добавлением среды Игла, модифицированной GIBCO по Дульбекко (DMEM) (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс) в удвоенном объеме трипсина. Затем кортикальный слой растирали с помощью отполированной огнем пипетки Пастера. Затем диссоциированные нейроны пропускали через сетчатый фильтр для клеток 40 мкм (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) и центрифугировали при 900 об / мин в течение 4 минут. Полученный осадок ресуспендировали в нейробазальной среде (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), содержащей 2% B27 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), 1% глутамин (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) и 1% пенициллин-стрептомицин (P / S) (Sigma-Aldrich Canada Corp., Oakville, ON) и высевали при плотности 50 000 клеток / см ² на поли-D-лизин (PDL) 30 000–70 000 Да (Sigma-Aldrich Corp., Oakville, ON), покрытые 96-луночные планшеты (Sarstedt Inc. ., Сен-Леонар, Квебек). Клетки хранили в увлажненном инкубаторе при 37 ° C, содержащем 95% воздуха и 5% CO2. Через 3 дня in vitro (DIV) половину культуральной среды заменяли для добавления Ara-c в конечной концентрации 1 мкМ для ингибирования роста глиальных клеток. На 5 DIV половину культуральной среды заменили свежей средой.Культуры использовали после 7 DIV.

Клеточные линии

клеток N1E-115 (CRL-2263, ATCC, Manassas, VA) были приобретены у производителя и выращены в колбе T-75 (Sarstedt Inc., Saint-Léonard, QC) с DMEM / F12 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA. ) с добавлением 10% FBS, 5% лошадиной сыворотки (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) и 1% P / S в инкубаторах при 37 ° C с 95% воздуха и 5% CO2. Клетки пассировали еженедельно при конфлюэнтности 70–80%. Клетки N1E-115 дифференцировали путем культивирования на планшетах, покрытых PDL, при плотности 15 000 клеток / см. ² в среде DMEM с 1% FBS и 1.5% диметилсульфоксид при 37 ° C, содержащий 95% воздуха и 5% CO2. Клетки использовали 5–7 DIV. Клетки HT22 (SCC129, Millipore Sigma, Берлингтон, Массачусетс) были любезно предоставлены лабораторией доктора Джереми Сивака и выращены в колбах Т-75 с DMEM, дополненной 10% FBS и 1% P / S, в инкубаторах при 37 ° C с 95% воздух и 5% CO2. Клетки пассировали еженедельно при конфлюэнтности 70–80%. Клетки HT22 были дифференцированы путем посева на планшеты, покрытые PDL, в полной ростовой среде, которую заменили нейробазалом, содержащим 1% добавку N-2 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), 1% глутамин и 1% P / S в течение 24 часов перед использованием. .Клетки RPE1 (CRL-4000, ATCC, Manassas, VA) были любезно предоставлены лабораторией доктора Уильяма Тримбла и выращены в колбах Т-75 в среде DMEM / F12, содержащей 10% FBS и 1% P / S, в инкубаторах при 37 ° C с 95% воздуха и 5% CO2. Клетки пассировали еженедельно при конфлюэнтности 70–80%. Для экспериментов клетки RPE1 высевали на планшеты, покрытые PDL, в полную питательную среду. Когда культуры становились конфлюэнтными, среду для роста заменяли бессывороточной DMEM с 1% P / S в течение 24 часов для индукции цилиогенеза перед использованием.

Тест на апоптоз и пролиферацию, индуцированный этопозидом

Клетки предварительно обрабатывали либо тубастатином А (Selleckchem, Houston, TX, Каталожный №S8049) или ингибитора сияния I (Selleckchem, Хьюстон, Техас, № по каталогу S1451) за 1 час до травмы. Апоптоз индуцировали 24-часовой обработкой 50 мкМ этопозида (Sigma-Aldrich Canada Corp., Oakville, ON). Выживаемость клеток оценивали путем инкубации культур с 0,5 мг / мл МТТ (Sigma-Aldrich Canada Corp., Оквилл, Онтарио) при 10% объема культуры в течение 4 часов при 37 ° C. Полученные кристаллы МТТ растворяли в ДМСО в течение 1 минуты при осторожном встряхивании. Аналогичным образом реагент для анализа пролиферации WST-8 (Sigma-Aldrich Corp., Oakville, ON) добавляли к среде для культивирования клеток в количестве 10% от объема культуры в течение 4 часов при 37 ° C. Считывающее устройство для микропланшетов Tecan Fluoroskan (Männedorf, Швейцария) использовали для измерения оптической плотности раствора при длине волны 570 нм с эталонной длиной волны 620 нм или 450 нм для тестов MTT и WST-8 соответственно.

Пересечение зрительного нерва

За всеми животными ухаживали в соответствии с Канадским советом по уходу за животными. Во всех экспериментах использовали взрослых самок крыс-альбиносов Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Senneville, QC), свободных от обычных патогенов.Их содержали в помещениях для животных Университета Торонто, в среде с контролируемым патогеном, в стандартных клетках с 12-часовым циклом свет / темнота. Еда и вода предоставлялись по мере необходимости.

Для хирургических процедур животных индивидуально анестезировали изофлураном (2%; 0,8% л / мин скорость потока кислорода) и помещали в стереотаксическую рамку с введением анестезии через противогаз для поддержания седативного эффекта. Лубрикант Tears Naturale (Alcon Canada Inc., Миссиссауга, Онтарио) наносили на роговицу для предотвращения высыхания во время операции.Для минимизации боли и помощи в послеоперационном восстановлении всем животным была сделана одна предоперационная инъекция кетопрофена (5 мг / мл, доза для крыс; 0,1 мл / 100 г массы тела). Для доступа к зрительному нерву в ткани, покрывающей верхнюю границу глазничной кости, делали разрез с последующим рассечением содержимого верхней глазницы и втягиванием вышележащих прямых мышц. Дуральная оболочка, окружающая зрительный нерв, была разрезана в продольном направлении, чтобы не повредить кровеносные сосуды, кровоснабжающие сетчатку.Для перерезки зрительного нерва нерв осторожно извлекали из оболочки менингеальной оболочки и разрезали в пределах 2 мм от задней части глаза. Затем содержимое глазницы было возвращено в исходное положение, и начальный разрез был закрыт. После операции животные были помещены в клетку для восстановления под нагревательной лампой. На следующий день крысам внутрибрюшинно вводили кетопрофен (5 мг / мл, доза для крыс; 0,1 мл / 100 г массы тела), чтобы минимизировать послеоперационный дискомфорт. Офтальмологическая глазная мазь снова была нанесена на роговицу, чтобы убедиться, что она оставалась гидратированной в течение периода восстановления.

Внутриглазные инъекции

Поскольку апоптоз RGC начинается через 3-4 дня после травмы [23,24], существует окно для доставки лечения, нацеленного на апоптотический аппарат. 4 мкл тубастатина A или ингибитора Aurora A, растворенного в ДМСО, вводили через 3 и 10 дней после операции. Для введения внутриглазных инъекций животных анестезировали изофлураном и помещали в стереотаксическую рамку под постоянной анестезией (2% изофлуран; скорость потока кислорода 0,8% л / мин), подаваемой через противогаз.Для внутриглазных инъекций использовали вытянутую стеклянную микропипетку, присоединенную к шприцу Hamilton объемом 10 мкл через гидравлическое соединение. Инъекция производилась в стекловидную камеру глаза, позади лимба, с осторожностью, чтобы предотвратить повреждение хрусталика или передних структур глаза. После введения соответствующего раствора пипетку удерживали на месте в течение 5 секунд, чтобы предотвратить рефлюкс, а затем осторожно вынимали из глаза. Инъекции выполнялись под хирургическим микроскопом для визуализации входа пипетки в соответствующее место и подтверждения доставки раствора в камеру стекловидного тела.

ДНК-конструкция, упаковка AAV2 и инфекция нейронов

Векторы AAV2, используемые для экспрессии EGFP и shRNA, были сконструированы и упакованы VectorBuilder (Cyagen Biosciences, Санта-Клара, Калифорния). Последовательности shRNA перечислены ниже. Вся экспрессия shRNA управлялась промотором U6, тогда как индикатор EGFP управлялся промотором фосфоглицераткиназы (PGK). Последовательности векторов следующие:

IFT88: 5’-TTGACGAAGACGATAAATATA CTCGAG TATATTTATCGTCTTCGTCAA-3 ’

Kif2a: 5’-CCTGGGATGTGATGGTTATTT CTCGAG AAATAACCATCACATCCCAGG-3 ’

HEF1: 5’-GAAAGGACTGGTTGAATAATT CTCGAG AATTATTCAACCAGTCCTTTC-3 ’

PLK1: 5’-CCTCTCACAGTCCTTAATAAA CTCGAG TTTATTAAGGACTGTGAGAGG-3 ’

NDE1 5’-ACTTCCAGCTGAAGCTATATT CTCGAG AATATAGCTTCAGCTGGAAGT-3 ’

Контроль: 5’-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG CTCGAG CGAGGGCGACTTAACCTTAGG-3 ’

TCHP: 5’-GAGGTCACACACTGCTTTATA CTCGAG TATAAAGCAGTGTGTGACCTC-3 ’

RGC были инфицированы AAV2 путем внутриглазной инъекции 4 мкл исходного титра вируса (> 10 ¹¹ GC) и 1 мкл 0.0002% проназы E (Sigma-Aldrich Corp., Оквилл, Онтарио) для переваривания внутренней ограничивающей мембраны сетчатки и улучшения проникновения вируса через GCL. Все инъекции проводились в лабораториях BSL2 животноводческого центра U of T персоналом, обученным биобезопасности и обращению с AAV2. Приблизительно 3 недели давали на экспрессию shРНК перед перерезкой зрительного нерва или экстракцией сетчатки.

Вестерн-блоттинг

Животных анестезировали в камере, содержащей 4% изофлурана, чтобы уменьшить страдания перед эвтаназией из-за смещения шейных позвонков.Глубина анестезии подтверждена защемлением пальца стопы. Глаза были энуклеированы, и сетчатку немедленно экстрагировали ледяным PBS. Сетчатку по отдельности обрабатывали ультразвуком в 400 мкл растворов ледяного SDS-буфера для лизиса (2% SDS, 0,3% DTT, 10% глицерина в 40 мМ Трис-Cl, pH 6,8) перед денатурацией (нагревали до 90 ° C в течение 8 минут). и удаление клеточного мусора центрифугированием (12000 об / мин, 10 мин, 4 ° C). Белки разделяли с помощью SDS-PAGE на 4–20% полиакриламидных гелях Bio-Rad TGX, а затем переносили полусухим методом на 0.Нитроцеллюлозная мембрана с размером пор 2 мкм. Мембраны блокировали в 5% молочном растворе на 1 час при комнатной температуре. Первичные антитела растворяли в 1% молоке, и блоты инкубировали в растворе в течение ночи при 4 ° C на платформе-качалке. Вторичное антитело конъюгировали с HRP, и блоты инкубировали во вторичном режиме в течение 1 часа при комнатной температуре на платформе-качалке. Визуализацию выполняли с использованием тепловизора Bio-Rad Fluor-S Max (Bio-Rad, Mississauga, ON). Нагрузку проверяли повторным зондированием блотов антисывороткой, направленной против GAPDH (1: 1000; кроличьи поликлональные; Cell Signaling Technology).

Иммуногистохимия и количественная оценка выживаемости RGC

Сетчатка для плоского монтажа.

Животных анестезировали в камере, содержащей 4% изофлурана, чтобы уменьшить страдания перед эвтаназией из-за смещения шейки матки. Глубина анестезии подтверждена защемлением пальца стопы. Животных умерщвляли через 7 или 14 дней после перерезки зрительного нерва. Глаза были энуклеированы, и наглазники, содержащие сетчатку, были зафиксированы в 4% параформальдегиде (PFA) (Bioshop Canada Inc., Берлингтон, ОН) в течение 1 часа при комнатной температуре.Затем сетчатку экстрагировали, промывали 3 × 10 мин в PBS и блокировали в PBS, содержащем 0,3% Triton X-100 (TPBS), 3% нормальную ослиную сыворотку (NDS) (Sigma-Aldrich Corp., Oakville, ON) и 1 % Бычьего сывороточного альбумина (BSA) (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс) в течение 1 часа. После блокирования образцы инкубировали с первичными антителами в блокирующем растворе в течение ночи при 4 ° C в концентрациях, перечисленных ниже. Образцы промывали 3 × 10 мин в PBS и инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными с флуорофорами Cy2 или Cy3 (1: 500) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) в течение ночи при 4 ° C. Наконец, образцы промывали 3 × 10 мин в PBS и устанавливали на плоской поверхности. Сетчатку закрывали раствором 50:50 глицерин / PBS и покрывали лаком для ногтей.

Использовали следующие первичные антитела:

Кроличьи поликлональные анти-ACIII (Санта-Крус Биотехнология, Даллас, Техас, sc-588, 1: 250), Козьи поликлональные анти-Brn3a (Санта-Крус Биотехнология, Даллас, Техас, sc-31984, 1: 250), мышиные моноклональные антитела -AcTub (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, sc-23950, 1: 100), мышиный моноклональный анти-pRb (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, sc-377528, 1: 250), козий поликлональный анти-SSTR3 (Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, sc-11617, 1: 250), Мышиные моноклональные антитела против NeuN (United States Biological, Салем, Массачусетс, N2173, 1: 250), Поликлональные анти-RBPMS морских свинок (Phosphosolutions, Aurora, CO, 1832-RBPMS, 1: 500), кроличьи поликлональные анти-RBPMS (Phosphosolutions, Aurora, CO, 1830-RBPMS, 1: 500), козьи поликлональные анти-Ki67 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, sc-7844, 1: 100),

Сетчатку глаза визуализировали с помощью камеры Andor iXon 885+ EMCCD (Andor Technology, Белфаст, Северная Ирландия), присоединенной к микроскопу Leica DM LFSA (Leica Microsystems, Конкорд, Канада), с источником света Sutter Lambda XL (Quorum Technologies, Гуэлф, Канада).Для измерения плотности RGC образцы были взяты при трех разных эксцентриситетах квадрантов сетчатки: внутреннем (1/6 радиуса сетчатки от центра), среднем (1/2 радиуса сетчатки от центра), внешнем (5/6 сетчатки от центра). радиус от центра).

Поперечные срезы сетчатки.

Животным вводили внутрисердечную перфузию 4% PFA и изолировали наглазник. Наглазник подвергали дальнейшей фиксации в 4% PFA в течение 1 часа при комнатной температуре и промывали PBS (3 × 15 минут). Затем наглазник подвергали криозащите путем погружения в 30% сахарозу в PBS до тех пор, пока ткань не перестала быть плавучей в растворе сахарозы (1-2 дня).Затем сетчатку делали на срезы с помощью микротома-криостата Leica CM1950. Поперечные срезы толщиной 14 мкм собирали на предметные стекла, покрытые APTEX (Sigma-Aldrich Corp., Oakville, ON), и хранили при -20 ° C до проведения иммуноокрашивания.

Иммуногистохимия выполнялась с антителами, направленными против pRb и RBPMS. Водоотталкивающая граница была нарисована вокруг срезов сетчатки с помощью бумажной ручки, чтобы сконцентрировать раствор антител в образцах. Поперечные срезы нервов инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичными антителами, разведенными в TPBS, содержащем 3% NDS и 1% BSA.После периода инкубации с первичным антителом срезы промывали трижды в PBS в течение 15 минут. После этого следовали 3-часовой инкубационный период с вторичным антителом, конъюгированным с Cy3 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA), при комнатной температуре и три последующих 15-минутных полоскания в PBS. Затем срезы закрывали смесью 50:50 глицерин / PBS. Образцы исследовали с помощью инвертированного моторизованного микроскопа AxioObserverZ1 (Carl Zeiss Canada Ltd., Торонто, Онтарио), оборудованного CSU-X1 SDC (Yokogawa Canada Inc., Калгари, AB) с камерой высокого разрешения Axiocam 506 (Carl Zeiss Canada Ltd., Торонто, Онтарио). Вариация глубины ткани и фокуса учитывалась во время визуализации путем захвата увеличенной глубины резкости, созданной путем объединения проекций максимальной интенсивности Z-стека в Zen 2 (Carl Zeiss Canada Ltd., Торонто, Онтарио).

Иммуногистохимия клеточных культур.

Для иммунофлуоресценции клеточных культур клетки выращивали на покровных стеклах, предварительно покрытых (PDL) (Neuvitro, Vancouver, WA), и фиксировали 4% PFA в течение 10 минут.Покровные стекла промывали 3 раза PBS, повышали проницаемость с помощью TPBS в течение 10 минут и блокировали PBS, содержащим 1% BSA и 3% NDS. Покровные стекла покрывали первичными антителами, разведенными в блокирующем буфере при 4 ° C в течение ночи, и промывали 3 раза PBS перед инкубацией со вторичными антителами в блокирующем растворе при комнатной температуре в течение 1 часа. Первичные и вторичные антитела разводили до указанных выше концентраций.

TUNEL assay.

Срезы сетчатки инкубировали в растворе, содержащем 0.67% концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы, 0,67% биотина dUTP, 20% CoCl2 (Roche Diagnostics, Индианаполис, Индиана) в течение 2 часов при 37 ° C. Затем образцы промывали 3 × 10 минут 1% -ным твином PBS и инкубировали в 1% -ном растворе PBS-твин с конъюгатом стрептавидина Alexa 555 (1: 750, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывания 3 × 10 мин 1% PBS твина образцы закрывали и герметизировали в растворе 50:50 глицерин / PBS.

Z-стеки конфокальной микроскопии с вращающимся диском

Для создания трехмерных изображений первичных ресничек для измерения длины инвертированный моторизованный микроскоп AxioObserverZ1 (Carl Zeiss Canada Ltd., Торонто, Онтарио), оборудованный SDC CSU-X1 (Yokogawa Canada Inc., Калгари, AB), с камерой высокого разрешения Axiocam 506 (Carl Zeiss Canada Ltd., Торонто, Онтарио) в лаборатории микроскопической визуализации Университета Торонто. . Подобно выборке плотности RGC, изображения были получены при трех различных эксцентриситетах (внутренний, средний, внешний) квадрантов сетчатки с использованием масляной линзы объектива 63x (Carl Zeiss Canada Ltd., Торонто, Онтарио). Z-стеки были созданы из изображений с помощью программного обеспечения Zen 2 (Carl Zeiss Canada Ltd., Торонто, Онтарио). Z-стеки анализировали с использованием Imaris (Bitplane, Белфаст, Соединенное Королевство) для определения длины ресничек.

Статистический анализ

Непарный двусторонний t-критерий Стьюдента использовался для определения статистической значимости между двумя группами. Значение p <0,05 считалось статистически значимым. Среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM) для каждой группы отображается в результатах. GraphPad InStat использовался для проведения статистического анализа (GraphPad Software Inc., Ла-Хойя, Калифорния). Статистически значимые различия между обработками, которые использовались для оценки выживаемости RGC после аксотомии, были рассчитаны с помощью апостериорных тестов Тьюки после ANOVA.

Результаты

Сублетальный гипоксический стресс вызывает укорочение ресничек, которое отменяется нормоксией

Чтобы исследовать, может ли ACC модулироваться первичными ресничками, мы стремились установить, изменяют ли апоптотические стимулы экспрессию ресничек в нейронах. Гипоксическое повреждение использовалось, потому что его можно легко контролировать и прекратить, и было показано, что оно индуцирует повторный вход в клеточный цикл в постмитотических нейронах [25,26].Дифференцированные культуры нейробластомы N1E-115 мыши подвергали гипоксии в течение 5 часов, затем возвращали в нормоксические условия на дополнительные 24 часа. Экспрессию ресничек исследовали с помощью иммунофлуоресценции против маркера аксонемы, ацетилированного альфа-тубулина (AcTub). Первичные реснички наблюдались в прегипоксических культурах нормальных клеток (рис. 1А, слева), но отсутствовали через 5 часов после гипоксии, а AcTub рассредоточен по цитоплазме (рис. 1А, в центре). Напротив, культуры, которые были возвращены в нормоксические условия после гипоксии, демонстрировали повторную экспрессию первичных ресничек, которые были короче по длине по сравнению с прегипоксическими клетками (Рис. 1A, справа).Затем мы измерили жизнеспособность N1E-115 и обнаружили значительное увеличение метаболической активности через 5 часов гипоксии, одновременно с ретракцией ресничек, которая вернулась к нормальным уровням после 24 часов нормоксии (рис. 1C, ** p <0,01). Затем мы воспроизвели эти фенотипы в иммортализованной линии клеток гиппокампа мыши HT-22. Эти клетки также демонстрируют устойчивую экспрессию ресничек (рис. 1B, слева), которая исчезает после гипоксии (рис. 1B, в центре). Кроме того, эти культуры демонстрировали такое же цитоплазматическое распределение AcTub, которое было характерно для клеток N1E-115 после гипоксии.Когда культуры, подвергшиеся воздействию гипоксии, возвращались к 24-часовой нормоксии, культуры аналогичным образом повторно экспрессировали укороченные реснички (рис. 1B, справа). Эти находки подтверждают, что гипоксический инсульт вызывает ретракцию первичных ресничек, и клетки, которые выживают при гипоксии, повторно экспрессируют реснички после первоначального распространения AcTub по цитоплазме.

Рис. 1. Гипоксия вызывает обратимую резорбцию нейрональных ресничек.

(A и B) Нормальные клетки N1E-115 (слева A) и культуры HT22 (слева B) демонстрировали первичные реснички (стрелки на A), продемонстрированные иммунофлуоресценцией против Actub.Пять часов гипоксии (в центре) привели к потере первичных ресничек и диффузному окрашиванию Actub в обеих клеточных линиях (средняя панель). После гипоксии 24 часа нормоксии вернули экспрессию первичных ресничек в обеих клеточных линиях (справа). N1E-115 Масштабная линейка = 25 мкм, масштабная шкала HT22 = 10 мкм. (C) Количественная оценка выживаемости клеток N1E-115 с помощью анализа WST-8, показывающая повышенную метаболическую активность через 5 часов гипоксии, которая нормализовалась после 24 часов нормоксии. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего по отношению к норме.** р <0,01.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220056.g001

Стабильность первичных ресничек влияет на апоптоз нейронов

После наблюдения корреляции между гипоксическим стрессом и резорбцией ресничек мы оценили, будет ли принудительная разборка ресничек влиять на выживаемость нейронов после травмы. Учитывая, что мутации компонентов IFT препятствуют собственному цилиогенезу и лежат в основе заболеваний, возникающих в результате мальформации ресничек [27,28], мы ингибировали моторный белок dynein, чтобы нарушить сборку и поддержание первичных ресничек.Для этого мы обработали реснитчатые клетки пигментного эпителия сетчатки 1 (RPE1) 30 мкМ цилиобревин D (рис. 2А), ингибитора мотора динеин-АТФазы. Через 24 часа произошла потеря первичных ресничек, замененная дезорганизованной полимеризацией AcTub (рис. 2А, правый столбец), напоминающей расположение тубулина в обработанных гипоксией линиях нейрональных клеток. Учитывая, что цилиобревин D разрушает первичные реснички, мы установили кривую доза-токсичность для цилиобревина D с культурами N1E-115 (Рис. 2B). Цилиобревин D становился токсичным для клеток N1E-115 при концентрациях 10 мкМ и выше (рис. 2B, * p <0.05 и ** p <0,01). Иммуногистохимия для AcTub показала, что 30 мкМ концентрации цилиобревина D вызывали потерю нейритов и ресничек в N1E-115 (рис. 2C).

Рис. 2. Нарушение IFT удаляет реснички и повышает чувствительность клеток N1E-115 к гипоксии.

(A) Ингибирование динеина через 24 часа обработки Ciliobrevin D нарушило нормальную организацию аксонемы, что привело к потере первичных ресничек в клетках RPE1 и нарушению организации тубулина (справа). Зеленый = рецептор соматостатина 3, красный = ацетилированный альфа-тубулин.Масштабная линейка = 10 мкм. (B) Кривая токсичности N1E-115 Ciliobrevin D, измеренная с помощью анализа WST-8 (G) (** p <0,01, * p <0,05), демонстрирующая увеличение клеточной токсичности при более высоких концентрациях. (C) Типичные микрофотографии иммунофлуоресценции против AcTub в нормальных клетках N1E-115 для идентификации первичных ресничек (стрелка) по сравнению с культурой, обработанной 30 мкМ Ciliobrevin D (справа). Первичные реснички были потеряны, и невриты также были удалены. (D) Количественная оценка выживаемости N1E-115 с помощью WST-8 после гипоксии. Обработка цилиобревином D увеличивала чувствительность к сублетальной гипоксии по сравнению с контролем ДМСО, который не оказывал эффекта.** р <0,01, * р <0,05. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220056.g002

Чтобы определить, сенсибилизирует ли клетки к апоптотическим стимулам разрушение ресничек, клетки N1E-115 предварительно обрабатывали в течение ночи минимально токсичными концентрациями 1 мкМ или 10 мкМ Цилиобревин. D. Эти культуры затем подвергали 8-часовой гипоксии, которая была сублетальной для контроля, обработанного ДМСО. Культуры, обработанные как 1 мкМ, так и 10 мкМ Ciliobrevin D, показали значительное увеличение гибели клеток после 8 часов гипоксии по сравнению с контролем (рис. 2D, ** p <0.01), что указывает на то, что потеря ресничек увеличивает чувствительность нейронов к апоптозу.

Затем мы оценили, может ли предотвращение резорбции ресничек предотвратить дегенерацию нейронов. С этой целью мы культивировали первичные нейроны коры головного мозга крыс, которые несут реснички при созревании (Рис. 3A). Первичные реснички кортикальных нейронов визуализировали с помощью иммунофлуоресценции против аденилилциклазы III (ACIII) [29]. Мы наблюдали, что без каких-либо этапов очистки количество иммунопозитивных клеток GFAP превышало количество нейронов в наших культурах (рис. 3B и 3C), поэтому глиальное загрязнение было устранено обработкой культур AraC.Этопозид, ингибитор топоизомеразы, использовался для повреждения нейронов, поскольку было показано, что он вызывает повторное вступление в клеточный цикл кортикальных нейронов крыс [30]. Более того, Di Giovanni et al. (2005) обнаружили, что ингибиторы CDK флавопиридол, росковитин и оломоуцин снижают гибель клеток после лечения этопозидом in vitro , подтверждая, что соединение является индуктором АСС.

Рис. 3. Тубастатин A, но не ингибитор Aurora A, защищает очищенные первичные культуры кортикальных нейронов от этопозида.

(A) Микрофотография, показывающая, что культивируемые первичные кортикальные нейроны покрыты ресничками (стрелки). Масштабные линейки = 10 мкм. (B) Типичные изображения первичных культур кортикальных нейронов с обработкой AraC и без нее, демонстрирующие пролиферацию глиальных клеток в культуре без обработки. Масштабная полоса = 100 мкм. (C) Количественная оценка клеточных культур с обработкой AraC или без нее, показывающая значительно более высокую долю GFAP-положительных клеток в культурах без очистки AraC. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.(D) Типичные изображения кристаллизации МТТ в выживших корковых нейронах после токсичности этопозида в нормальных (необработанных) культурах, контрольных культурах с ДМСО или ТБА. (E) Обработка TBA значительно увеличивала выживаемость клеток после инсульта этопозидом по сравнению с контролем DMSO, но не в культурах, которые не получали AraC. (F) Количественная оценка выживаемости кортикальных нейронов после лечения ингибитором AurA I, показывающая повышенную гибель клеток после повреждения этопозидом.

https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0220056.g003

Чтобы помешать ретракции ресничек, мы использовали тубастатин A (TBA), ингибитор HDAC6, и ингибитор Aurora Kinase A I (AAi). AAi в 1000 раз более селективен к AurA, чем киназа Aurora B [31]. Тубастатин А является высокоселективным в отношении HDAC6 с 1000-кратной большей селективностью по отношению к другим изоформам, за исключением HDAC8, где он имеет 57-кратную большую избирательность [32]. Было показано, что TBA восстанавливает экспрессию ресничек в холангиокарциноме [33] и предотвращает децилизацию RPE1 за счет сверхэкспрессии HDAC6 [34].Предварительная обработка культур кортикальных нейронов 100 мкМ TBA приводила к значительному увеличению выживаемости от апоптоза, индуцированного этопозидом, по сравнению с контролями DMSO, как измерено с помощью анализа MTT (фиг. 3D и 3E, ** p <0,01). Интересно, что нейропротекторные эффекты TBA были отменены в культурах нейронов, которые не были очищены от глиальных клеток (рис. 3E). Это предполагает, что TBA обеспечивает нейрозащиту посредством ингибирования клеточного цикла, а не стабилизацию экстрацилиарного нейронального тубулина, поскольку он цитотоксичен для делящихся глиальных клеток.Напротив, хотя ингибирование AurA стабилизирует реснички от индуцированной сывороткой резорбции [12], AAi не оказывал нейропротекторного действия для культивируемых кортикальных нейронов крыс (Fig 3F).

Пересечение зрительного нерва вызывает абортивный клеточный цикл и укорочение ресничек в ганглиозных клетках сетчатки

Мы дополнительно исследовали взаимосвязь между первичными ресничками и ACC in vivo , используя модель повреждения ЦНС при перерезке зрительного нерва (ONT) у взрослых крыс. ONT приводит к апоптотической дегенерации 90% ганглиозных клеток сетчатки (RGC) в течение 14 дней после аксотомии [35].Во-первых, мы стремились подтвердить ONT как подходящую модель нейронального ACC. Мы исследовали экспрессию pRb в RGCs после ONT, поскольку этот белок клеточного цикла наблюдается в ряде человеческих и экспериментальных моделей патологий ЦНС [25,36-40]. Кроме того, pRb является критическим маркером клеточного деления, инициируя повторное вхождение в клеточный цикл [41]. Через 1, 4 и 7 дней после ONT сетчатки были подвергнуты криосрезу и RGC были идентифицированы путем зондирования РНК-связывающего белка с помощью множественного сплайсинга (RBPMS). Наивные крысы не показали экспрессии pRb в RGC, тогда как RGC через 1, 4 и 7 дней после аксотомии показали заметное ядерное окрашивание на pRb (рис. 4A), подтверждая, что ONT индуцировал клеточный цикл.Поскольку экспрессия pRb была ограничена слоем ганглиозных клеток (GCL), мы провели вестерн-блот-анализ целых лизатов сетчатки и аналогичным образом обнаружили повышение pRb через 1, 4 и 7 дней после ONT (рис. 4B).

Рис. 4. ONT индуцирует экспрессию pRb.

(A) Иммунофлуоресцентные микрофотографии поперечных срезов сетчатки, показывающие ядерную экспрессию pRb в RGC после ONT, через 1, 4 или 7 дней после аксотомии. Масштабная линейка = 100 мкм. (B) Вестерн-блоттинг целых лизатов сетчатки, демонстрирующий повышенные уровни pRb в пересеченных сетчатках.Каждая полоса представляет собой целую сетчатку.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220056.g004

Чтобы дополнить экспрессию pRb, мы исследовали Ki67, который обнаруживается во всех фазах клеточного цикла и, как сообщается, присутствует во время ACC [26 , 38,42]. Мы обнаружили положительную иммунореактивность Ki67 в GCL аксотомированных сетчаток (рис. 5A). Кроме того, мы также обнаружили фрагментацию ДНК с помощью анализа TUNEL в аксотомизированных RGC (рис. 5B), который подтвердил, что апоптоз происходил одновременно с цикличностью клеток.

Рис. 5. ONT индуцирует экспрессию Ki67 и повреждение ДНК в RGC.

(A) Иммунофлуоресцентные микрофотографии поперечных срезов сетчатки, показывающие диффузную экспрессию Ki67 в GCL после ONT, через 1, 4 или 7 дней после аксотомии. Масштабная линейка = 50 мкм. (B) Иммунофлуоресцентные микрофотографии поперечных срезов сетчатки, показывающие экспрессию TUNEL в RGC после ONT, через 1, 4 или 7 дней после аксотомии. Масштабная линейка = 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220056.g005

После подтверждения того, что аксотомированные RGCs подвергались ACC, мы предположили, что будет происходить укорочение или полная потеря ресничек RGC после ONT. Чтобы точно определить длину первичных ресничек, реснички визуализировали в трехмерных Z-стеках с помощью конфокальной микроскопии (Рис. 6A). RGCs были идентифицированы с использованием Brn3α, ядерного маркера, который маркирует более 90% RGCs [43]. Используя 3D-реконструкции GCL, мы количественно определили длину ресничек RGC из наивных сетчаток, а также сетчатки через 7, 10 и 14 дней после ONT.Сначала мы оценили общую длину ресничек по разным эксцентриситетам сетчатки (внутренняя, средняя, ​​внешняя) в указанные моменты времени (рис. 6С). Было отмечено значительное уменьшение длины ресничек после аксотомии при всех эксцентриситетах сетчатки; аксотомизированные RGCs содержат реснички, которые были примерно вдвое короче тех, что обнаруживаются в нормальных RGCs (Рис. 6C, ** p <0,01). Чтобы лучше понять изменения длины ресничек после ONT, реснички были расслоены на короткие (<4 мкм), средние (4-7,5 мкм) и длинные группы (> 7.5 мкм) (рис. 6D). Это выявило непрерывные изменения доли длины ресничек во всех измеренных временных точках после аксотомии. Это выявило резкое уменьшение доли длинных ресничек вместе с увеличением доли коротких ресничек (Рис. 6D, ** p <0,01). Доля ресничек средней длины оставалась стабильной через 7 дней после аксотомии; однако наблюдалось значительное увеличение их доли через 10 дней после аксотомии, возможно, из-за продолжающегося исчезновения коротких ресничек за счет полной резорбции (Рис. 6D, * p <0.05).

Рис. 6. ONT вызывает укорочение ресничек в RGC.

(A) Репрезентативное изображение создания трехмерных вокселей иммуноокрашивания для ресничек (серый) и ядер RGC (красный), используемых в количественной оценке ресничек. (B) Слева: репрезентативное изображение иммунофлуоресцентного Z-стека наивной сетчатки, показывающее ядра RGC (красный) и реснички (зеленый). Справа: репрезентативное изображение иммунофлуоресцентного Z-стека сетчатки через 14 дней после ONT. Шкала шкалы = 20 мкМ. (C) Средняя длина первичных ресничек RGC (мкМ) ± SEM, до и после ONT.** р <0,01. (D) Количественная оценка ресничек RGC в нормальной и аксотомированной сетчатке, стратифицированной по длине. ONT индуцировал значительное увеличение доли коротких ресничек и резкое уменьшение доли длинных ресничек в каждый момент времени после ONT. ** р <0,01. * р <0,05. (E) Среднее количество первичных ресничек RGC ± SEM, определенное количественно до и после ONT. ** р <0,01. (F) Средний процент реснитчатых RGC ± SEM. Ресничные RGC были значительно уменьшены после аксотомии, что указывает на полную потерю ресничек в некоторых RGC после повреждения (* p <0.05, ** p <0,01). Всего было измерено> 50 ресничек для каждой группы, n = 3 сетчатки на группу.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220056.g006

Как и ожидалось, количество ресничек RGC уменьшилось со временем, которое коррелировало со смертью RGC после ONT [35], со значительным сокращением количества ресничек. через 7 дней после ONT, который продолжался до 14 дней (рис. 6E, ** p <0,01). Более того, процент реснитчатых RGC значительно снизился после ONT (рис. 6F, * p <0.05, ** p <0,01). В нормальных сетчатках можно было объяснить 88,5 ± 2,5% ресничек RGC, но это уменьшилось до 71,0 ± 5% через 7 дней после аксотомии (** p <0,01), а затем снизилось до 60 ± 5,7% через 10 дней (* р <0,05). Интересно, что через 14 дней после травмы наблюдалось увеличение ресничек RGC. Это может быть связано с замедлением гибели RGC через 2 недели после ONT и увеличенной выживаемостью оставшихся RGC [35,44], приводящей к более высокой доле реснитчатых клеток, которые выжили после ACC.

Модуляция резорбции ресничек влияет на чувствительность ганглиозных клеток сетчатки к апоптозу

Продемонстрировав, что поврежденные RGCs одновременно претерпевают клеточный цикл и резорбцию ресничек, мы стремились связать два явления, манипулируя стабильностью ресничек и исследуя его влияние на выживаемость нейронов.Во-первых, мы нацелились на специфический для ресничек белок IFT88 для нокдауна. IFT88 является белковой субъединицей внутрижгутикового комплекса B, и его мутации приводят к неспособности образовывать реснички [45,46]. Мы стабильно трансдуцировали RGC с помощью shRNA, кодирующих вирусные векторы, посредством внутриглазной инъекции аденоассоциированного вируса 2 (AAV2) (> 4 × 10 ⁸ GC на сетчатку) (рис. 7A, справа). Конфокальные Z-стеки показали, что через 3 недели после вирусной инъекции положительные по shРНК EGFP-IFT88 клетки демонстрировали значительно более короткие реснички (2.4 ± 0,9 мкм) по сравнению с нормальными и контрольными RGC, обработанными shРНК (фиг. 7B, 5,6 ± 1,0 мкм и 6,1 ± 1,0 мкм, ** p <0,01). Кроме того, процент мерцательных клеток значительно снизился в сетчатке, обработанной IFT88 shRNA (47,1 ± 6,0%), по сравнению с нормальной и контрольной сетчаткой (90,9 ± 2,5% и 89,7 ± 1,3%, рис. 7C, ** p <0,01). Затем проводили ONT на крысах, обработанных векторами, кодирующими shRNA IFT88. По сравнению с контрольной shRNA, сетчатка, экспрессирующая shRNA IFT88, показала значительно сниженную выживаемость RGC при всех эксцентриситетах сетчатки через 7 дней после аксотомии (рис. 7D и 7E, ** p <0.01).

Рис. 7. КшРНК IFT88 укорачивает реснички и усиливает дегенерацию RGC после ONT.

(A) Слева: микрофотографии сетчатки, установленной на плоской поверхности, демонстрирующие иммуномечение ACIII первичных ресничек в RBPMS-положительных RGC. Справа: микрофотографии, показывающие GFP-положительные RGC, экспрессирующие векторы AAV2, кодирующие кшРНК IFT88. Масштабные линейки = 10 мкм. (B и C) Длина ресничек RGC (B) и доля реснитчатых RGC (C) уменьшались через 3 недели после инъекции вектора AAV2-IFT88-shRNA. ** р <0,01. (D) Типичные эпифлуоресцентные микрофотографии иммуномеченных RBPMS RGC во внутреннем эксцентриситете плоских сетчаток через 7 дней после ONT, экспрессирующих контрольную shRNA (вверху) или IFT88 shRNA (внизу).Масштабная линейка = 100 мкм. (E) Количественная оценка RGC, показывающая, что экспрессия кшРНК IFT88 значительно снижает выживаемость RGC через 7 дней после ONT по сравнению с контрольной шпилькой со скремблированием. ** p <0,01, n = 4 сетчатки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220056.g007

Поскольку усечение ресничек усугубило гибель RGC после ONT, мы проверили противоположную возможность, что стабилизация ресничек фармакологическим ингибированием белков разборки ресничек может способствовать выживанию RGC. TBA (6.8 мкг / мкл) или AAi (2,9 мкг / мкл), разведенные в ДМСО, вводили отдельно в камеру стекловидного тела через 3 и 7 дней после ONT. Сетчатку извлекали через 2 недели после ONT, и выживаемость RGC количественно определяли с помощью иммуномечения RBPMS [24]. Наблюдалось значительное увеличение выживаемости RGC после лечения TBA или AAi при количественной оценке через 14 дней после аксотомии (рис. 8A и 8B, ** p <0,01).

Рис. 8. Ингибирование разборки ресничек защищает RGC и подавляет клеточный цикл после ONT.

(A) Типичные эпифлуоресцентные микрофотографии, показывающие RGC, иммуно меченные RBPMS, во внутреннем эксцентриситете плоских сетчаток через 14 дней после ONT, с обработкой DMSO (вверху) или TBA (внизу).Масштабная линейка = 100 мкм. (B) Количественная оценка RGC после интравитреальной инъекции TBA (n = 4 сетчатки) или ингибитора AurA I (n = 5 сетчатки), демонстрирующая значительно увеличенную выживаемость RGC через 14 дней после ONT по сравнению с контрольной обработкой DMSO (** p < 0,01). (C) Эпифлуоресцентные микрофотографии, показывающие RGC с иммуноактивными RBPMS в среднем эксцентриситете плоских сетчаток через 14 дней после ONT, после доставки контроля (скремблированная shRNA) или AAV-HEF1-shRNA. Масштабная линейка = 100 мкм. (D) Количественная оценка выживаемости RGC через 14 дней после ONT с опосредованной AAV2 экспрессией shРНК, нацеленной на HEF1, NDE1, PLK1 или Kif2a.ShRNA значительно увеличивали выживаемость аксотомированных RGC по сравнению с скремблированным контролем (n = 4 сетчатки на обработку) (** p <0,01, * p <0,05). (E) Вестерн-блоттинг целых лизатов сетчатки из нормальной сетчатки или сетчатки через 5 дней после ONT, причем каждая полоса представляет собой целую сетчатку. ShRNA против HEF1, Kif2a, NDE1, PLK1 или TCHP снижали уровни pRb по сравнению со скремблированной контрольной shRNA.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220056.g008

Основываясь на этих находках, мы нацелены на дополнительные белки разборки ресничек для AAV-опосредованного нокдауна с помощью shRNA.Нокдаун HEF1, PLK1 или Kif2a приводил к значительному улучшению выживаемости RGC при всех эксцентриситетах сетчатки (рис. 8C и 8D, ** p <0,01) по сравнению с сетчатками, которые получали контрольные (скремблированные) вирусные векторы, экспрессирующие shРНК. Кроме того, нокдаун NDE1 привел к значительному увеличению RGC в среднем и внешнем эксцентриситетах (рис. 8D, * p <0,05) по сравнению с контролем.

Наконец, мы исследовали экспрессию pRb с помощью вестерн-блоттинга в сетчатках, обработанных AAV-shRNA, через 4 дня после ONT.Повышенные уровни pRb, которые были обнаружены в сетчатках, экспрессирующих контрольную shRNA, были снижены в сетчатках, экспрессирующих shRNA против HEF1, Kif2a, NDE1, PLK1 или Trichoplein (рис. 8E). В совокупности эти находки показывают, что разборка ресничек играет роль в инициации абортивного повторного входа в клеточный цикл, и вмешательство в процесс ресорбции ресничек может ослабить клеточный цикл и апоптоз нейронов в нейронах ЦНС взрослых млекопитающих.

Обсуждение

Участие повторного входа клеточного цикла в апоптоз нейронов было продемонстрировано на животных моделях и патологоанатомических исследованиях ЦНС человека [5].Первичные реснички очень важны в этом отношении, так как признано, что они являются привратниками клеточного цикла, секвестрируя центриоли на клеточной мембране [21]. Насколько нам известно, это первая демонстрация того, что повреждение нейронов вызывает укорочение первичных ресничек и что ингибирование механизма разборки ресничек снижает повторное вступление в клеточный цикл. Таким образом, мы обращаемся к несоответствию, которое существует между знанием о контроле цилиарного клеточного цикла и наблюдением повторного входа в клеточный цикл при нейрональных заболеваниях и повреждениях.

Мы обнаружили, что как гипоксия, так и ONT индуцируют укорочение ресничек в линиях нейрональных клеток и RGCs соответственно. В сочетании с предыдущими исследованиями, показывающими, что ACC инициируется в др. Моделях апоптоза нейронов, это наблюдение подчеркивает связь между резорбцией ресничек и инициацией передачи сигналов пролиферации [26,47]. Кроме того, повышенная метаболическая активность клеток N1E-115, наблюдаемая через 5 часов гипоксического стресса, соответствует энергоемкому характеру активации клеточного цикла.Когда клетки возвращались к нормоксии и метаболическая активность нормализовалась, происходила одновременная повторная экспрессия первичных ресничек, указывающая на возможное обращение инициации клеточного цикла и спасение выживших клеток. Кроме того, мы продемонстрировали, что укорочение первичных ресничек усиливает апоптоз, поскольку оно сенсибилизирует культивируемые нейроны к гипоксии и ускоряет дегенерацию RGCs после ONT. Это предположительно происходит за счет ускоренного входа в ACC, потому что было показано, что более длинные реснички задерживают прогрессирование клеточного цикла [17].

В отличие от принудительного укорачивания ресничек, фармакологическое ингибирование HDAC6 защищает культуры кортикальных нейронов от апоптоза, индуцированного этопозидом; однако только культуры нейронов, которые были очищены от глиального загрязнения, обладали этим преимуществом, что указывает на то, что TBA действует через ингибирование клеточного цикла и токсичен для других митотических клеток. Напротив, ингибирование AurA увеличивает гибель кортикальных нейронов. Это может быть связано с ранней ролью AurA в удлинении нейритов за счет активации белка ядерного распределения nudE-like1 [48].AurA обильно экспрессируется в молодых постмитотических нейронах, и его ингибирование может отрицательно повлиять на растущую культуру кортикальных нейронов, маскируя любые защитные эффекты стабилизации ресничек. Это подчеркивает, что некоторые функции белков перекрываются между нейрогенезом и разборкой ресничек, вероятно, связанными со способностью реорганизовывать тубулин и важностью инактивации при созревании нейронов. Ингибирование HDAC6 и AurA вместе с нокдауном shRNA HEF1, NDE1, PLK1 или Kif2a оказывало нейрозащитное действие по отношению к RGC после ONT.Более того, эти обработки, наряду с нокдауном TCHP, снижали уровни экспрессии pRb в RGC после ONT, демонстрируя, что нейропротекция происходит посредством первичного опосредованного ресничками подавления ACC. Снижение уровней pRb является решающим признаком прекращения клеточного цикла, поскольку pRb означает преодоление точки рестрикции, когда клетка необратимо предана пролиферации [49]. Это уменьшение pRb дополняет предыдущие открытия, что активность белков разборки ресничек повышается в прогрессии клеточного цикла, но их нокдаун или ингибирование отменяет пролиферацию [13,17,50-52].

Дополнительные белки, участвующие в разборке ресничек, которые не были исследованы в нашем исследовании, но заслуживают упоминания, это Pitchfork (Pifo) и Tctex. Pifo активирует AurA и концентрируется в базальном теле узловых ресничек эмбрионов мышей на ранних стадиях разборки ресничек [53]. Tctex-1 представляет собой компонент легкой цепи динеина, который активирует локальную полимеризацию F-актина, чтобы запустить эндоцитоз цилиарного кармана и ускорить резорбцию ресничек [54]. Гаплонедостаточность Pifo приводит к дефектам разборки ресничек [53], тогда как нокдаун shRNA Tctex-1 нарушает резорбцию ресничек, вызывая преждевременную дифференцировку нейральных клеток-предшественников [55].Нацеливание на эти белки при апоптозе нейронов может представлять интерес для будущих исследований ACC.

Общность ACC подтверждается его наблюдением на животных моделях болезней Альцгеймера, Хантингтона и Паркинсона, а также инсульта и черепно-мозговой травмы [36,56-59]. Более того, митогенные маркеры, такие как ядерный антиген пролиферирующих клеток, pRb, циклины и CDK, были обнаружены в образцах ЦНС пациентов с болезнью Альцгеймера и Паркинсона, тогда как пациенты с болезнью Хантингтона и БАС продемонстрировали повышенные уровни pRB и циклина D1 в ЦНС.Это подчеркивает важность изучения механизмов контроля клеточного цикла, которые применимы к множеству моделей дегенерации ЦНС, с целью разработки терапевтических стратегий для этих неизлечимых заболеваний. С этой целью повсеместность первичных ресничек среди нейронов и их широкий контроль над клеточным циклом делают реснички идеальной мишенью для предотвращения нейрональной патологии в ЦНС взрослых.

Наше исследование сфокусировано на компоненте разборки ресничек, но механизм, с помощью которого резорбция передается в цитоплазму или ядро, полностью не изучен [60].Предполагается, что ресничный контроль клеточного цикла происходит посредством секвестрации регуляторов клеточного цикла внутри органелл. Таким образом, втягивание ресничек высвобождает эти молекулярные сигналы в ядро, чтобы инициировать клеточный цикл [60,61]. Это может происходить посредством путей передачи сигналов Wnt и Hh, которые модулируются ресничками [60,61]. Активация канонического пути Wnt приводит к накоплению β-катенина, который активирует транскрипцию циклина D [62]. Джуберин (Jbn) связывается с β-катенином, чтобы предотвратить его протеасомную деградацию и помогает перемещать его в ядро ​​[63].Lancaster et al. (2011) продемонстрировали, что в эмбриональных фибробластах мышей (MEF) первичные реснички секвестируют Jbn от тела клетки с помощью IFT и нарушение ретроградного IFT вызывает накопление Jbn на дистальном конце ресничек. Кроме того, индукция бицилитации в клетках MEF снижает ядерный β-катенин и ответ Wnt [64]. Это указывает на то, что разборка ресничек высвобождает дополнительный Jbn в цитозоль, чтобы увеличить зависимую от β catenin активацию клеточного цикла [61,64].

Hh происходит через его поверхностные рецепторы, Patched (Ptc), и его эффекторы Hh, факторы транскрипции Gli1-3, которые локализованы внутри ресничек [65].Эти эффекторы активируют гены, участвующие в пролиферации и метастазировании [66]. В отсутствие Hh Gli2 неактивен, а Gli3 процессируется в свою репрессорную форму Gli3R в ресничках [67]. При стимуляции Hh Ptc снимает ингибирование Smo, который перемещается в ресничку, чтобы предотвратить процессинг Gli3R. Это активирует Gli2, чтобы способствовать транскрипции Gli1 [65,68,69]. Gli1-3 затем способствует транскрипции Cyclin D, Cyclin E и E2F1, чтобы ускорить переход G1 / S [70]. Поскольку и Gli, и Jbn концентрируются в ресничках [65], деконструкция органелл с помощью HDAC6 и его активаторов может высвобождать эти факторы в ядро, чтобы инициировать пролиферацию [61].Дальнейшее выяснение этого механизма представляет собой следующий шаг в понимании цилиарной регуляции ACC. В заключение, наше исследование далее разрушает давнюю догму о том, что первичные реснички являются рудиментарными органеллами, демонстрируя их важность в поддержании покоя нейронов и регуляции запрограммированной гибели клеток в ЦНС взрослых млекопитающих.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить доктора Моше Кима из лаборатории доктора Уильяма Тримбла в Центре Питера Гилгана за его щедрое пожертвование линии клеток RPE1 и Dr.Джереми Сивак из Исследовательского института Крембил за щедрое пожертвование линии клеток HT22.

Ссылки