Пп белки: Правильное питание. Белки – Лайфхакер

( A ) Схематическое изображение конструкции экспрессии полноразмерного белка SARS-CoV-2 S. Сегменты S1 и S2 включают NTD, RBD, CTD1, CTD2, S1 / S2, S2 ‘, FP, FPPR, HR1, CH, CD, HR2, TM, CT и древовидные символы для гликанов. Стреп-метку сливали с С-концом S-белка гибким линкером.( B ) Очищенный белок S разделяли гель-фильтрационной хроматографией на колонке Superose 6 в присутствии NP-40. Стандарты молекулярной массы включают тиоглобулин (670 кДа), γ-глобулин (158 кДа) и овальбумин (44 кДа). Три основных пика (пики I, II и III) содержат белок S. ( C ) Загружаемый образец и фракции пиков из (B) анализировали с помощью SDS-PAGE, окрашенного кумасси синим. Меченые полосы были подтверждены вестерн-блоттингом (S, S1 и S2) или секвенированием белков (S2 и Cont; полосы S и S1 не дали каких-либо значимых результатов, вероятно, из-за заблокированного N-конца).Cont, совместно очищенный загрязняющий белок, идентифицированный как предшественник BiP шаперона эндоплазматического ретикулума путем N-концевого секвенирования. * Предполагаемый фрагмент S1 / S2-S2 ‘. Также показаны репрезентативные изображения и двумерные средние значения трех фракций пиков, полученные с помощью ЭМ отрицательного окрашивания. Размер ящика двумерных средних составляет ~ 510 Å.

С тех пор, как была выпущена первая последовательность генома SARS-CoV-2 ( 21 ), сообщалось о нескольких структурах для S-белковых комплексов, включая эктодомен, стабилизированный в конформации до слияния ( 22 – 24 ) и RBD -АСЕ2 комплексы ( 25 – 28 ) (рис.S1), опираясь на предыдущий успех структурной биологии белков S из других CoV ( 20 ). В стабилизированном S-эктодомене S1 складывается в четыре домена, N-концевой домен (NTD), RBD и два C-концевых домена (CTD), и защищает префузионную конформацию S2, в которой HR1 отклоняется назад к вирусной мембране. (рис. S1, A и B). RBD выбирает две различные конформации: «вверх» представляет состояние, доступное для рецептора, а «вниз» – состояние, недоступное для рецептора.Структуры, представляющие состояние после слияния S2 от вируса гепатита мышей (MHV) (рис. S1E), и структуры с более низким разрешением от SARS-CoV (рис. S1F) предполагают, как структурные перестройки S2 протекают, способствуя слиянию мембран и проникновению вируса. ( 29 , 30 ). Сравнение состояний до и после слияния показывает, что HR1 претерпевает переход «складной нож», который может вставлять слитый пептид (FP) в мембрану клетки-мишени. При складывании HR2 FP и трансмембранные (TM) сегменты располагаются на одном конце молекулы, в результате чего мембраны, с которыми они взаимодействуют, изгибаются друг к другу, эффективно приводя к слиянию мембран.В предыдущих структурах области около вирусной мембраны либо не присутствовали, либо были неупорядоченными, но все они, по-видимому, играли критические структурные и функциональные роли ( 31 – 35 ).

Чтобы получить более глубокое понимание, мы стремились определить состояния до и после слияния полноразмерного белка S дикого типа SARS-CoV-2.

Результаты

Очистка интактного S-белка

Для получения функционального S-белка SARS-CoV-2 мы трансфицировали клетки 293 эмбриональной почки человека (HEK) с помощью конструкции экспрессии полноразмерной S-последовательности дикого типа с С-концевой Strep-tag (рис.1А). Эти клетки эффективно сливались с клетками, трансфицированными интактной конструкцией ACE2 человека, даже без добавления каких-либо дополнительных протеаз (рис. S2), что позволяет предположить, что S-белок, экспрессируемый на поверхности клеток, полностью функционален для слияния мембран. С-концевой Strep-tag не влиял на эффективность слияния. Чтобы очистить полноразмерный S-белок, мы лизировали клетки и солюбилизировали все мембраносвязанные белки в 1% детергенте NP-40. Затем меченый Strep S-белок был захвачен на смоле Strep-Tactin в 0.3% НП-40. Очищенный белок S элюируется из колонки для исключения размера в виде трех отдельных пиков в 0,02% NP-40 (фиг. 1B). Анализ с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, окрашенным кумасси синим (SDS-PAGE) (рис. 1C), показал, что пик 1 содержит как нерасщепленный предшественник S, так и расщепленный комплекс S1 / S2; пик 2 имел в основном расщепленный, но диссоциированный фрагмент S2; и пик 3 включал в основном диссоциированный фрагмент S1, что было оценено с помощью N-концевого секвенирования и вестерн-блоттинга (фиг. S3).Это было подтверждено с помощью электронной микроскопии (ЭМ) с отрицательным окрашиванием (рис. 1С). Пик 1 показал самое сильное связывание с растворимым ACE2, сравнимое с таковым для очищенного растворимого тримерного S-эктодомена, а пик 2 показал самое слабое связывание, поскольку он содержал в основном фрагмент S2 (фиг. S4). Хотя расщепление по сайту S1 / S2 (фурин) было четко продемонстрировано секвенированием белка N-конца фрагмента S2 в пике 2, расщепление по сайту S2 ‘не было очевидным. В некоторых препаратах мы наблюдали полосу около 20 кДа, размер, ожидаемый для фрагмента S1 / S2-S2 ‘(рис.1С). Мы получили аналогичный профиль гель-фильтрации при использовании другого детергента (додецилмальтозида) для солюбилизации S-белка (рис. S5), предполагая, что диссоциация S-белка во время гель-фильтрационной хроматографии не запускается каким-либо конкретным детергентом. Мы также идентифицировали основной загрязняющий белок в препарате как предшественник шаперон-связывающего белка эндоплазматического ретикулума (BiP) ( 36 ), который может играть роль в облегчении укладки S-белка.

Определение структуры Cryo-EM

Крио-EM изображения были получены с выбранными сетками, подготовленными из всех трех пиков на электронном микроскопе Titan Krios, работающем при 300 кэВ и оборудованном энергетическим фильтром BioQuantum и детектором прямых электронов Gatan K3.RELION ( 37 ) использовался для отбора частиц, двухмерной (2D) классификации, трехмерной классификации и уточнения. Определение структуры выполнялось с помощью этапов трехмерной классификации, уточнения и скрытого местного уточнения, как описано в дополнительных материалах. Конечное разрешение составляло 2,9 Å для белка S перед слиянием и 3,0 Å для белка S2 в конформации после слияния (фиг. S6 – S9).

Структура тримера S до слияния

Общая архитектура полноразмерного S-белка в конформации до слияния была очень похожа на опубликованные структуры растворимого S-тримера, стабилизированного С-концевой меткой тримеризации фолдона и двумя заменами пролина при граница между HR1 и центральной спиралью (CH) в S2 (рис.S1) ( 22 , 23 ). В нашей новой структуре упорядочены N-конец, несколько периферических петель и гликаны, которые были невидимы в структурах растворимых тримеров (рис. 2, A и B, и рис. S10A). Как описано ранее, четыре домена фрагмента S1, NTD, RBD, CTD1 и CTD2, охватывают тройную ось, покрывая фрагмент S2 внизу. Сайт расщепления фурина на границе S1 / S2 находится в открытой и неупорядоченной петле (рис. 2В), поэтому неясно, представляет ли эта структура нерасщепленный или расщепленный тример, хотя образец явно содержит обе формы (рис.1С). Точно так же фрагмент S2 имеет конформацию, почти идентичную конформации в предыдущих структурах тримеров, при этом большая часть полипептидной цепи упакована вокруг центральной трехцепочечной спиральной спирали, образованной СН, включая коннекторный домен (CD), который связывает СН и C-концевой HR2 через дополнительную линкерную область. Различие между нашей структурой и опубликованными структурами тримеров состоит в том, что сегмент из 25 остатков в S2 сразу после гибридного пептида упорядочен. Сегменты HR2, TM и CT, которые не наблюдались в предыдущих структурах, все еще не видны.

( A ) Структура тримера S моделировалась на основе карты плотности 2,9 Å. Три протомера (A, B и C) окрашены в зеленый, синий и красный цвета соответственно. ( B ) Общая структура белка S в конформации до слияния показана в виде ленты. Различные структурные компоненты в цветовой схеме, показанной на рис. 1A, включают NTD, RBD, CTD1, CTD2, FP, FPPR, HR1, CH и CD.Указаны N-конец, сайт расщепления S1 / S2 и сайт расщепления S2 ‘.

Наша структура отличается от ранее описанных конформаций перед сваркой несколькими особенностями. Во-первых, N-конец в нашей структуре упорядочен и принимает конформацию, аналогичную конформации SARS-CoV, включая дисульфидную связь (Cys ¹⁵ –Cys ¹³⁶ ) и N-связанный гликан в Asn ¹⁷ (рис. . 3А) ( 38 ). Будет важно подтвердить, разворачивается ли эта область без дисульфидной связи в стабилизированных растворимых конструкциях или она сложена и просто плохо определяется по плотности, несмотря на дисульфидную связь, особенно если эти конструкции широко используются для исследований вакцин.

( A ) N-концевой сегмент белка S. N-конец находится у остатка Gln ¹⁴ после отщепления сигнального пептида. Cys ¹⁵ образует дисульфидную связь с Cys ¹³⁶ . Мы наблюдали хорошую плотность для N-связанного гликана в Asn ¹⁷ . ( B ) Сегмент, расположенный непосредственно ниже слитого пептида, обозначенный как FPPR, хотя и неупорядочен в структуре стабилизированного растворимого тримерного S-эктодомена, образует плотно упакованную структуру, примыкающую к CTD1.Недавно идентифицированная структура FPPR будет конфликтовать с CTD1 в конформации RBD up. Различные области показаны в цветовой схеме на фиг. 2B. Структура растворимого тримера S с одним RBD в восходящей конформации (ID PDB: 6vyb) показана серым цветом. В рамке показан увеличенный вид FPPR с соседним гибридным пептидом как в виде поверхности, так и в виде палочки. ( C ) Тример S перед слиянием SARS-CoV-2, если смотреть вдоль оси третьего порядка, накладывается на структуру стабилизированного растворимого тримерного S-эктодомена в закрытой конформации со всеми тремя RBD в нижней конформации (PDB ID: 6vxx ).Хотя область S2 хорошо выровнена, существует значительный сдвиг (например, ~ 12 Å между двумя остатками Ala ¹²³ ) в S1. ( D ) Влияние мутаций пролина, введенных в остатки 986 и 987, на стабилизацию конформации до слияния. Мутация K986P удаляет солевой мостик между Lys ⁹⁸⁶ одного протомера и либо Asp ⁴²⁷ , либо Asp ⁴²⁸ другого протомера в интерфейсе тримера.

Во-вторых, другой дисульфидсодержащий сегмент (остатки с 828 по 853) непосредственно после гибридного пептида также отсутствует в структурах растворимого эктодомена, но упорядочен в нашей структуре (рис.3Б). Мы обозначили его как проксимальную область гибридного пептида (FPPR). FPPR неупорядочен как в закрытой, так и в RBD-восходящей конформациях стабилизированного растворимого тримера S. В нашей полноразмерной структуре он довольно плотно упаковывается вокруг внутренней дисульфидной связи между Cys ⁸⁴⁰ и Cys ⁸⁵¹ , дополнительно усиленной солевым мостиком между Lys ⁸³⁵ и Asp ⁸⁴⁸ , а также обширным сеть водородных связей. По сравнению с конформацией RBD-вверх путем наложения остальной части S2, FPPR конфликтует с CTD1, который вращается наружу с RBD в переходе с переворачиванием вверх.Таким образом, структурированный FPPR, примыкающий к противоположной стороне CTD1 от RBD, по-видимому, помогает зажать RBD и стабилизировать закрытую конформацию S-тримера. Не очевидно, почему FPPR также не виден в опубликованной закрытой структуре S-эктодомена со всеми тремя RBD в нисходящей конформации ( 23 ). Наша структура полноразмерного S-белка предполагает, что CTD1 является структурным реле между RBD и FPPR, которое может ощущать смещение с обеих сторон. Последний напрямую связан с гибридным пептидом.Отсутствие структурированного FPPR в стабилизированном растворимом тримере S может объяснить, почему в этом препарате легко обнаруживается конформация RBD-up. Кроме того, предполагается, что мутация D614G, которая была идентифицирована в недавних изолятах SARS-CoV-2, приводит к более эффективному проникновению ( 39 , 40 ). D614 образует солевой мостик с K854 в FPPR (рис. S10B), поддерживая функциональную роль FPPR в слиянии мембран. В трехмерной классификации наших частиц до слияния из двух независимых наборов данных наблюдался только один подкласс с перевернутым RBD (рис.S6), предполагая, что конформация RBD-up относительно редко встречается в нашем препарате S полной длины. Карта для этого подкласса была уточнена до 4,7 Å без симметрии C3, и мы не смогли смоделировать FPPR. FPPR упорядочен на всех других картах с разрешением 3,5 Å или выше.

Когда мы выровняли нашу полноразмерную структуру со структурой растворимого тримера S по части S2, три субъединицы S1 в структуре растворимого тримера переместились наружу, от оси третьего порядка, до ~ 12 Å в периферийных областях (рис.3C и рис. S11), предполагая, что полноразмерный тример S более плотно упакован среди трех протомеров, чем мутантный растворимый тример. Исследуя область рядом с мутациями пролина между HR1 и CH, мы обнаружили, что мутация K986P, по-видимому, устраняет солевой мостик между Lys ⁹⁸⁶ в одном протомере и либо Asp ⁴²⁷ , либо Asp ⁴²⁸ в другом протомере; таким образом, мутация может создать чистый заряд (три на один тример) внутри границы раздела тримера. Это может объяснить, почему растворимый тример с мутацией PP имеет более рыхлую структуру, чем полноразмерный S с последовательностью дикого типа.Приводит ли это ослабление к неупорядоченным FPPR в закрытом тримере, потребует дополнительных экспериментальных доказательств. Однако мутации пролина, предназначенные для дестабилизации конформации после слияния и усиления структуры до слияния, также могут влиять на структуру до слияния.

Структура тримера S2 после слияния

Трехмерная реконструкция образца из пика 2 дала структуру тримера S2 после слияния, показанную на фиг. 4A. Общая архитектура SARS-CoV-2 S2 в конформации после слияния почти идентична архитектуре опубликованной структуры, полученной из эктодомена S2 MHV, продуцируемого в клетках насекомых (рис.S1) ( 29 ). В структуре HR1 и CH образуют необычно длинную центральную трехцепочечную спиральную спираль (~ 180 Å). Коннекторный домен вместе с сегментом (остатки с 718 по 729) во фрагменте S1 / S2-S2 ‘образуют трехцепочечный β-лист, который инвариантен между структурами до и после слияния. В состоянии после слияния остатки с 1127 по 1135 присоединяются к β-листу соединителя, расширяя его на четыре нити, одновременно проецируя C-концевой HR2 к вирусной мембране. Другой сегмент (остатки 737-769) во фрагменте S1 / S2-S2 ‘составляет три спиральные области, заблокированные двумя дисульфидными связями, которые упираются в канавку СН-части спиральной спирали, образуя короткую структуру пучка из шести спиралей. (6HB-1 на рис.4Б). Неясно, расщепляется ли сайт S2 ‘, потому что он находится в неупорядоченной области, охватывающей 142 остатка (Рис. 4B), как в структуре MHV S2. Тем не менее, фрагмент S1 / S2-S2 ‘является неотъемлемой частью постфузионной структуры и не диссоциирует независимо от расщепления по сайту S2’. N-концевой участок HR2 имеет спиральную форму с одним витком, а также упирается в канавку спиральной катушки HR1; С-концевой участок HR2 образует более длинную спираль, которая составляет вторую структуру пучка из шести спиралей с остальной частью спиральной спирали HR1 (6HB-2 на рис.4Б). Таким образом, длинная центральная спиральная катушка многократно усилена вдоль своей длинной оси, что делает ее очень жесткой структурой, что видно даже из средних значений частиц класса 2D на крио-ЭМ изображениях (рис. S8).

( A ) Структуру тримера S2 моделировали на основе карты плотности 3,0 Å. Три протомера (A, B и C) окрашены в зеленый, синий и красный цвета соответственно. ( B ) Общая структура тримера S2 в постфузионной конформации показана на ленточной диаграмме.Различные структурные компоненты в цветовой схеме, показанной на рис. 1A, включают HR1, CH, CD и HR1. Сайт расщепления S2 ‘находится в неупорядоченной петле между Ile ⁷⁷⁰ и Thr ⁹¹² . Также указаны возможные местоположения конца S2 N (сайт расщепления S1 / S2), FP и FPPR. ( C ) Карта с низким разрешением, показывающая структуру плотности для пяти N-связанных гликанов с почти равным интервалом вдоль длинной оси.

Отличительной особенностью постфузионного S2 является украшение его поверхности N-связанными гликанами (рис.4C), что также видно в средних значениях класса 2D (рис. S8). Пять гликанов на остатках Asn ¹⁰⁹⁸ , Asn ¹¹³⁴ , Asn ¹¹⁵⁸ , Asn ¹¹⁷³ и Asn ¹¹⁹⁴ расположены вдоль длинной оси с постоянным интервалом, а четыре из них выровнены на одной стороне тример. Если эти сайты гликозилирования полностью заняты разветвленными сахарами, то они могут экранировать большую часть поверхностей тримеров S2 после слияния. Подобная картина была недавно описана ( 41 ) для препарата SARS-CoV S2, полученного из растворимой конструкции эктодомена, продуцируемой в клетках насекомых и запускаемой протеолизом и низким pH.Причина этого украшения неясна, учитывая, что постфузионная структура выполнила свою миссию, и ее не нужно скрывать от иммунной системы.

Пик 3 содержит в основном диссоциированный мономерный фрагмент S1, который является самым маленьким (~ 100 кДа) и показывает самый низкий контраст в крио-ЭМ решетках из трех типов частиц, которые мы описываем. Мы выполнили предварительный анализ 3D-реконструкции (рис. S12), дополнительно подтвердив его идентичность.

Обсуждение

Архитектура S-белка на поверхности вириона SARS-CoV-2

Тот факт, что расщепленный комплекс S1 / S2 диссоциирует в отсутствие ACE2 и что фрагмент S2 принимает конформацию после слияния в мягких условиях детергента, предполагает что кинетический барьер для конформационного перехода, относящегося к проникновению вируса, неожиданно низок для этого S-белка.Неясно, связано ли это наблюдение напрямую с эффективным слиянием мембран или инфекцией. Тем не менее, стоит отметить, что тример S2 после слияния не только имеет очень стабильную и жесткую структуру, но также стратегически декорирован N-связанными гликанами вдоль своей длинной оси, как если бы он находился под селективным давлением для функций, отличных от процесса слияния мембран. Хотя некоторые предполагают, что вирусные слитые белки могут дополнительно олигомеризоваться в их постфузионной конформации, чтобы способствовать образованию пор слияния ( 42 ), выступающие поверхностные гликаны SARS-CoV-2 S2 делают этот сценарий маловероятным.Более вероятной является защитная роль, которую может играть постфузионная структура S2, если она также присутствует на поверхности инфекционного и зрелого вириона. Он может вызывать ненейтрализующие реакции антител для уклонения от иммунной системы хозяина, а также может защищать более уязвимые тримеры S1 / S2 перед слиянием в условиях вне хозяина, декорируя вирусную поверхность чередующимися жесткими шипами (рис. 5A). Несколько недавних отчетов предоставили некоторые доказательства, подтверждающие эту возможность.Во-первых, ЭМ-изображения препарата вируса SARS-CoV-2, инактивированного β-пропиолактоном, очищенного градиентом плотности тартрата калия и глицерина, по-видимому, потеряли все субъединицы S1, оставив только постфузионный S2 на поверхности вириона ( 43 ). Аналогичным образом, ЭМ-изображения кандидата на вакцину от вируса SARS-CoV-2 (PiCoVacc), инактивированного β-пропиолактоном, также показали игольчатые шипы на его поверхности ( 44 ). Во-вторых, сообщалось о спонтанном выделении SARS-CoV-2 S1 из псевдовирусов в отсутствие ACE2 ( 39 ).В-третьих, связывающие антитела против S2 легко обнаруживаются у пациентов с COVID-19 ( 45 ), что позволяет предположить, что S2 более подвержен воздействию иммунной системы хозяина, чем указывается незащищенными поверхностями на структурах перед слиянием ( 22 , 23 ) (Рис. 2). Поэтому мы предполагаем, что тримеры S2 после слияния могут выполнять защитную функцию, составляя часть короны на поверхности зрелого и инфекционного вириона SARS-CoV-2 (рис. 5). Спайки S2 после слияния, вероятно, образуются после спонтанной диссоциации S1 независимо от клеток-мишеней.

( A ) Структурные изменения не зависят от клетки-мишени. Мы предполагаем, что на поверхности зрелого вириона присутствуют как префузионные, так и постфузионные спайки, и соотношение между ними может варьироваться. Показана диаграмма вириона. Пики после слияния на вирионе образуются S2 после диссоциации S1 в отсутствие ACE2. ( B ) ACE2-зависимые структурные перестройки.Структурный переход от конформации до слияния к конформации после слияния, вызывающей слияние мембран, вероятно, происходит поэтапно, как показано ниже. Во-первых, FPPR зажимает RBD через CTD1 в тримере S перед слиянием (это исследование), но иногда смещается со своего места и позволяет RBD отбирать образец восходящей конформации (PDB ID: 6vyb). Во-вторых, связывание RBD с ACE2 (PDB ID: 6m17) создает гибкий FPPR, который позволяет выявить сайт расщепления S2 ‘непосредственно перед соседним FP. Расщепление по сайту S2 ‘, и, возможно, также по сайту S1 / S2, снимает структурные ограничения на слитый пептид и инициирует каскад событий рефолдинга в S2, вероятно, сопровождаемый полной диссоциацией S1.В-третьих, образуется длинная центральная трехцепочечная спиральная катушка, и HR2 отгибается. Наконец, формируется постфузионная структура S2 (это исследование), которая объединяет две мембраны, облегчая формирование поры слияния и проникновение вируса.

Мембранное слияние

Мы идентифицируем структуру около слитого пептида, FPPR, которая может играть критическую роль в слитых структурных перестройках S-белка. Похоже, что между RBD и FPPR существует перекрестное взаимодействие, опосредованное CTD1, потому что структурированный FPPR зажимает RBD, тогда как конформация RBD-up нарушает FPPR.Более того, FPPR находится близко к границе S1 / S2 и сайту расщепления S2 ‘и, таким образом, может быть центром активности, относящейся к конформационным изменениям в S. Одна возможность состоит в том, что один FPPR иногда смещается из положения из-за внутренней динамики белка, позволяя RBD отбирать верхнюю конформацию. Колебание такого рода приведет к разрыхлению всего S-тримера, как это наблюдается в модифицированных конструкциях растворимого S-тримера ( 22 , 23 ). Как только RBD фиксируется в верхнем положении за счет связывания с ACE2 на поверхности клетки-мишени, гибкий FPPR может сделать возможным экспонирование сайта расщепления S2 ‘непосредственно перед соседним слитым пептидом.Фенотип мутации D614G, по-видимому, согласуется с представлением о том, что FPPR участвует в слиянии мембран ( 39 , 40 ). Расщепление по сайту S2 ‘снимает структурные ограничения на слитый пептид, который может инициировать каскад событий рефолдинга в S2, включая образование длинной центральной трехцепочечной спиральной спирали; откидная спинка HR2; и в конечном итоге слияние мембран. Расщепление по сайту S1 / S2 делает возможным полную диссоциацию S1, что также может способствовать рефолдингу S2.

Вопросы относительно слияния мембран остаются, потому что области около вирусной мембраны все еще не видны на реконструкциях. Однако все эти регионы играют важнейшие структурные и функциональные роли. Например, консервативная гидрофобная область, непосредственно предшествующая домену TM, и, возможно, сам TM, как было показано, имеет решающее значение для тримеризации S-белка и слияния мембран ( 31 ). Считается, что цитоплазматический хвост, содержащий пальмитоилированную, богатую цистеином область, участвует в сборке вирусов и слиянии клеток ( 32 – 35 ).Могут ли другие вирусные белки, такие как белок М, помочь стабилизировать спайк за счет взаимодействия с HR2, остается открытым вопросом. Таким образом, нам по-прежнему нужна структура интактного S-белка с высоким разрешением в контексте мембраны и других вирусных компонентов, чтобы ответить на эти вопросы.

Соображения по поводу разработки вакцины

Безопасная и эффективная вакцина – это основной медицинский вариант снижения или устранения угрозы, исходящей от SARS-CoV-2. Первый цикл вакцин-кандидатов с различными формами S-белка вируса быстро проходит доклинические исследования на животных моделях и клинические испытания на людях.Наше исследование вызывает несколько потенциальных опасений по поводу текущих стратегий вакцинации. Во-первых, вакцины, использующие полноразмерную последовательность S-белка дикого типа, могут продуцировать различные формы in vivo, которые мы здесь наблюдали. Конформации после слияния могут открывать иммунодоминантные, не нейтрализующие эпитопы, которые отвлекают иммунную систему хозяина, как это было зарегистрировано для других вирусов, таких как ВИЧ-1 и RSV ( 46 , 47 ). Во-вторых, подход к стабилизации конформации до слияния путем введения мутаций пролина в остатки 986 и 987 может быть неоптимальным, поскольку мутация K986P может разрушить солевой мост между протомерами, который способствует стабильности тримеров.Полученная в результате структура S-тримера с расслабленной вершиной может индуцировать антитела, которые не могут эффективно распознавать шипы S-тримера на вирусе, хотя она может быть более эффективной в индукции нейтрализующих ответов против RBD, чем закрытая форма. В-третьих, учитывая возможность того, что постфузионный S2 присутствует на инфекционных вирионах, вакцины с использованием вирусов, инактивированных β-пропиолактоном, могут потребовать дополнительных тестов контроля качества. Хотя PiCoVacc, по-видимому, обеспечивает защиту от проблем у нечеловеческих приматов после трех иммунизаций ( 44 ), неясно, как минимизировать количество тримеров S2 после слияния, чтобы избежать вариаций партии.Дизайн иммуногена на основе структуры может быть особенно важным, если SARS-CoV-2 становится сезонным и возвращается с дрейфом антигенов, как и вирусы гриппа ( 48 ).

протеинфосфатаз и киназ | NEB

Мы используем файлы cookie, чтобы понять, как вы используете наш сайт, и улучшить общее впечатление пользователя. Это включает в себя персонализацию контента и рекламы. Чтобы узнать больше и управлять файлами cookie, обратитесь к нашему Положению о файлах cookie .

Киназа – это фермент, который присоединяет фосфатную группу к белку. Фосфатаза – это фермент, который удаляет фосфатную группу из белка.Вместе эти два семейства ферментов действуют, чтобы модулировать активность белков в клетке, часто в ответ на внешние раздражители. Настоящая система красный / зеленый свет, киназы обычно включают белок, а фосфатаза отключает белок.

Выберите тип:

Распознавание субстрата протеинкиназы

Легальная информация

Этот продукт защищен одним или несколькими патентами, товарными знаками и / или авторскими правами, принадлежащими или контролируемыми New England Biolabs, Inc (NEB).

Хотя NEB разрабатывает и проверяет свои продукты для различных приложений, использование этого продукта может потребовать от покупателя получения дополнительных прав интеллектуальной собственности третьих лиц для определенных приложений.

Для получения дополнительной информации о коммерческих правах, пожалуйста, свяжитесь с командой NEB по развитию глобального бизнеса по адресу gbd @ neb.com.

Этот продукт предназначен только для исследовательских целей. Этот продукт не предназначен для использования в терапевтических или диагностических целях у людей или животных.

Рекомендуемые товары

Другой связанный контент

Срок действия сеанса истек

Вы бездействовали более 20 минут, в целях безопасности вы вышли из системы. Пожалуйста, войдите снова, чтобы продолжить сеанс.

Войти

Учреждение изменено

Ваш профиль привязан к учреждению, пожалуйста, войдите еще раз, чтобы завершить обновление вашего профиля.

Войти

Идентификация неупорядоченных белков – группы и центры

Традиционный взгляд на структуру белка, созданный за тридцать лет определения структуры с помощью рентгеновских лучей, рассматривает атомы белка как фиксированные в пространстве относительно друг друга, в сложной форме, содержащей области локальной структуры, такие как α-спирали и β-листы.

Эта точка зрения, несомненно, верна для многих белков, однако ясно, что большое количество белков не имеет фиксированной структуры [1].Первоначально такие белки были идентифицированы, потому что области структуры не были видны в кристаллографических экспериментах по дифракции рентгеновских лучей, вследствие статического или динамического беспорядка [2,3]. Развитие методов ЯМР для исследования белковых структур в растворах сделало экспериментальное обнаружение структурных нарушений относительно простым, даже для больших белков [4]. Факторы, включая сложность аминокислотной последовательности и содержание заряженных и неполярных остатков, являются основными детерминантами нарушения [1-3,5].Применение таких соображений ко всем последовательностям генома с помощью биоинформатических инструментов привело к предположению, что большинство белков у некоторых эукариот, включая человека, имеют неупорядоченные домены длиной до пятидесяти аминокислот [2-3,6]. Внутренне неупорядоченные или «естественно развернутые» белки могут быть обычным явлением, поскольку нарушение приводит к высокой конформной энтропии, которая, как предполагается, является выгодной для белка, ищущего своего партнера по взаимодействию. Действительно, многие изначально развернутые белки сворачиваются в упорядоченную структуру при связывании с партнером [7,8], а дрожжевые белки с неупорядоченными областями из семидесяти или более смежных остатков имеют больше партнеров по взаимодействию белок-белок, чем другие белки [9].

Целью данной работы является исследование использования современных методов машинного обучения, таких как машина опорных векторов (SVM), искусственная нейронная сеть (ANN) и машина вектора релевантности (RVM) для идентификации областей в белках, не имеющих фиксированной структуры. , на основе данных аминокислотной последовательности. Методы обучения ядра, такие как SVM, кажутся особенно многообещающими для работы такого рода, поскольку они могут работать непосредственно со структурированными данными, такими как графики, деревья или, в данном случае, данные последовательности.

Online Disorder Prediction

Щелкните следующую ссылку, чтобы получить Online Disorder Prediction.

Выражение признательности

Эта работа была поддержана грантом по изменению дисциплины, предоставленным совместно Советом медицинских исследований Великобритании (MRC), Советом по исследованиям в области инженерных и физических наук (EPSRC) и Советом по исследованиям биотехнологий и биологических наук (BBSRC), находящимся под управлением MRC (грант № 67192 – «Прогнозирование белковых расстройств с помощью передовых инструментов машинного обучения»).

Каталожные номера

N.B. DOI представляет собой ссылку на онлайн-материалы через систему цифрового идентификатора объекта DOI, если таковая имеется.

1. Уверский В. Н., Естественно развернутые белки: точка, в которой биология ждет физики, Наука о белках, т. 11, pp. 739-756, 2002.
2. Дункер, А. К., Браун, К. Дж., Лоусон, Дж. Д. и Якучова, Л. М. и Обрадович, З., Внутреннее расстройство и функция белков, Биохимия, том. 41, нет. 21, pp 6573-6582, 2002. (DOI)
3. Dunker, A.К., Лоусон, Д. Д., Браун, Си-Джей, Уильямс, Р. М., Ромеро, П., О, Дж. С., Олдфилд, Си-Джей, Кэмпен, А. М., Рэтлифф, К. М., Хиппс, К. В., Аусио, Дж., Ниссен, М. С., Ривз , R., Kang, CH, Kissinger, CR, Bailey, RW, Griswold, MD, Chiu, W., Garner, EC, and Obradovic, Z., Внутренне неупорядоченный белок, Journal of Molecular Graphics and Modeling, vol. 19, нет. 1, стр. 26-59, 2001. (DOI)
4. Дайсон, Х. Дж. И Райт, П. Э., Методы ядерного магнитного резонанса для выяснения структуры и динамики в неупорядоченных состояниях, Методы в энзимологии, т.39, pp. 258-270, 2001.
5. Romero, P., Obradovic, Z., Li, X., Garner, EC, Brown, CJ, и Dunker, AK, Sequence sequence of беспорядок, Белки: структура, функция и Генетика, т. 42, нет. 1, pp. 38-48, 2000. (DOI)
6. Дункер А. К. и Обрадович З., Белковая троица – связывающая функция и нарушение, Nature Biotechnology, vol. 19, pp. 805-806, 2001. (DOI)
7. Дайсон, Х. Дж. И Райт, П. Э. Сцепление фолдинга и связывания для неструктурированных белков, Current Opinion in Structural Biology, vol.12, pp. 54-60, 2002. (DOI)
8. Томпа П., Внутренне неструктурированные белки, Trends in Biochemical Sciences, vol. 27, нет. 10, pp. 527-533, 2002. (DOI)
9. Лю, Дж. Ф., Тан, Х. П. и Рост, Б., Петлеобразные белки, по-видимому, консервативны в процессе эволюции, Journal of Molecular Biology, vol. 322, нет. 1, pp. 53-64, 2002. (DOI)

Доктор Гэвин Коули, доктор Стивен Хейворд и Джефф Мор (CAP).

Рекомбинантные белки, полученные из DSP-PP 240 и DSP 370

Контекст 1

… либо кДНК DSP-PP 240, либо кДНК DSP 370. После инфицирования клетки инкубировали в течение 4 дней, и рекомбинантные белки в собранной клеточной среде были частично очищены и сконцентрированы с использованием экстракции полианионов, разделены методом SDS-PAGE и окрашены Stains-All (см. «Материалы и методы»). ). Полученные профили белков показаны на фиг. 2. Пять основных полос синего окрашивания (т.е. полосы 1-5; BSA окрашивает оранжевый цвет) присутствовали в среде, полученной из клеток, инфицированных бактериофагом DSP-PP 240, тогда как три основных полосы синего окрашивания (я.е. полосы 1-3; BSA окрашивает оранжево-красный цвет) присутствовали в инфицированных DSP 370 клетках …

Контекст 2

… идентифицировать полосу 33 кДа 4 на фиг.2, профиль рекомбинантного белка, полученный из кДНК DSP 370 Конструкцию сравнивали с конструкцией, полученной из конструкции кДНК DSP-PP 240 (рис. 2, дорожки 1 и 2). Конструкция кДНК DSP 370 кодирует рекомбинантный белок размером 388 аминокислот (то есть белок DSP из 370 аминокислот плюс дополнительные 18 аминокислот …

Контекст 3

… идентифицировать полосу 33 кДа 4 на рис. 2, профиль рекомбинантного белка, полученный из конструкции кДНК DSP 370, сравнивали с профилем, полученным из конструкции кДНК DSP-PP 240 – struct (рис. 2, дорожки 1 и 2). Конструкция кДНК DSP 370 кодирует рекомбинантный белок размером 388 аминокислот (т.е. белок DSP из 370 аминокислот плюс дополнительная 18-аминокислотная последовательность, полученная из вируса). Полоса 2 представляет собой белок DSP из 388 аминокислот, который распознается антителом против DSP (не показано).Этот рекомбинантный белок DSP 370 не содержит …

Контекст 4

… 2 представляет собой белок DSP из 388 аминокислот, который распознается антителом против DSP (не показано). Этот рекомбинантный белок DSP 370 не содержит последовательности PP и короче полосы 2. Из фиг. 2 полосы 4 (33 кДа) и полосы 5 (29 кДа) не присутствуют в профиле DSP 370. Таким образом, эти полосы, скорее всего, представляют два белка, родственных PP. …

Контекст 5

… и не обнаружил последний пептид из 28 аминокислот (660-687) (т.е. SGNGNSDSDSDSDSEGSDSNHS-TSDD). Таким образом, полоса 5, скорее всего, представляет собой PP 211, в котором отсутствуют С-концевые 28 аминокислот (см. Фиг. 3D). Расчетное соотношение молекулярной массы белка PP 240 430, который состоит из DSP 350 и гликопротеина дентина (DGP 80). На фиг. 2 синяя полоса 1 (180 кДа), присутствующая в дорожке DSP 370, скорее всего, представляет димер DSP (полоса 2; 90 кДа). Синяя полоса 3 (70 кДа) и синяя полоса 3, присутствующие в дорожках DSP-PP 240 и DSP 370, соответственно, на рис.2, не всегда присутствовали в образцах рекомбинантных белков. Анализ масс-спектров показывает, что синяя полоса 3 представляет собой …

Контекст 6

… Расчетное соотношение молекулярной массы белка PP 240 430, который состоит из DSP 350 и гликопротеина дентина (DGP). 80). На фиг. 2 синяя полоса 1 (180 кДа), присутствующая в дорожке DSP 370, скорее всего, представляет димер DSP (полоса 2; 90 кДа). Синяя полоса 3 (70 кДа) и синяя полоса 3, присутствующие в дорожках DSP-PP 240 и DSP 370, соответственно, на рис.2, не всегда присутствовали в образцах рекомбинантных белков. Анализ масс-спектров позволяет предположить, что синяя полоса 3 представляет собой белок, подобный телокину-20 (т.е. связанный с бакуловирусом; данные не показаны). Таким образом, синяя полоса 3 могла быть произведена бакуловирусной системой. Меньшие слабые синие полосы между 22 и 6 кДа присутствовали в обоих продуктах, полученных из DSP-PP 240,

Контекст 7

… с бакуловирусом, содержащим кДНК DSP-PP 240. В разное время после заражения рекомбинантный DSP-PP 240 и родственные белки очищали из культуральной среды и запускали в 10% SDS-PAGE, который затем окрашивали Stains-All.Через 2 дня заражения наблюдались полосы, расположенные на уровне 120 кДа (т.е. DSP-PP 240) и 33 кДа (т.е. PP 240) (рис. 4A, дорожка …

Контекст 8

… и методы “) и инкубировали этот очищенный предшественник в 25 мМ Трис-HCl, pH 7,5, в течение 30 минут при 37 ° C. Полученный профиль белка показан на рис. 5. Первоначальный электроэлюированный DSP-PP 240 представлен в виде одного полоса (рис. 5, дорожка 1), которая затем претерпевает значительную белковую обработку в течение 30 мин с образованием полосы DSP 430 и полосы PP 240 (рис.5, дорожка 2). Таким образом, процессинг белка-предшественника DSP-PP 240, вероятно, не связан с протеазами в среде насекомых, что позволяет предположить, что вместо этого он может подвергаться …

Контекст 9

… кДа (то есть PP 240) (см.рис. 7, A (дорожка 1) и B (дорожка 1)), что указывает на желатинолитическую активность. В контрольных группах не наблюдалось белых полос в полианионных экстрактах среды, кондиционированной клетками насекомых Sf9, и в полианионных экстрактах сред, полученных из клеток насекомых Sf9, инфицированных бакуловирусом, содержащим антисмысловую кДНК DSP 370 (см. Рис.7, A (дорожки 2 и 3) и B (дорожка 2)). Это первое свидетельство того, что DSP-PP и PP обладают протеолитическими …

Контекст 10

… развитием и минеральными-240 и DSP 370 белками в системе экспрессии бакуловирусов. Рекомбинантный белок-предшественник DSP-PP 240, содержащий лидерную последовательность, был синтезирован из кДНК DSP-PP 240 в системе экспрессии бакуловируса. Лидерную последовательность удаляли, и белок-предшественник DSP-PP 240 секретировали в культуральную среду (см. Рис.2). Во время 30-минутной инкубации при 37 ° C в 25 мМ Трис-HCl, pH 7,5, белок-предшественник DSP-PP 240 был дополнительно переработан в DSP 430 и PP 240 (см. Фиг. 5). Лидерная последовательность белка-предшественника DSP-PP 240 изображена серым цветом, а N-концевая последовательность – черными полужирными буквами. Серый треугольник указывает на расщепление …

Контекст 11

… от кДНК DSP 370 в системе экспрессии бакуловируса. Лидерную последовательность удаляли, и белок-вирусную последовательность DSP 370 секретировали в культуральную среду.Размер белково-вирусной последовательности DSP 370 (т.е. 388 аминокислот) меньше, чем у DSP 430, и в профиле геля рекомбинантного белка DSP 370 не было полос, связанных с РР (см. Фиг. 2). Это позволяет точно настроить зародышеобразование минералов и рост гидроксиапатита на разных этапах программы минерализации (19). Мы использовали DSP-PP 240 инфицированные клетки насекомых Sf9 для получения и секреции рекомбинантного белкового продукта массой 120 кДа в кондиционированную клеточную среду (рис. 2, полоса 1). Анализ МС и МС / МС выявил ряд…

Контекст 12

… присутствовали в профиле геля рекомбинантного белка DSP 370 (см. Фиг. 2). Это позволяет точно настроить зародышеобразование минералов и рост гидроксиапатита на разных этапах программы минерализации (19). Мы использовали DSP-PP 240 инфицированные клетки насекомых Sf9 для получения и секреции рекомбинантного белкового продукта массой 120 кДа в кондиционированную клеточную среду (рис. 2, полоса 1). Анализ МС и МС / МС идентифицировал ряд распознаваемых триптических пептидов в части DSP предполагаемого белка-предшественника DSP-PP 240, а также обнаружение совпадающей аминокислотной последовательности PP 240 в положениях 524-542 (т.