Ккал и кал разница: В чем Разница Между Калориями и Килокалориями

Бактериальная масса в фекалиях и потери энергии у здоровых людей и пациентов с синдромом короткой кишки

Субъекты

Шесть здоровых добровольцев и шесть пациентов с SBC были изучены после их информированного согласия на протокол, который был одобрен этикой Комитет больницы Ларибуазьер.Здоровые добровольцы (четыре мужчины, две женщины, 39 ± 5 лет) не имели в анамнезе желудочно-кишечных или метаболических заболеваний. Пациенты с SBC (четыре мужчины, две женщины, 61 ± 7 лет) перенесли обширную резекцию кишечника, но у них осталось не менее двух третей оставшейся толстой кишки (таблица 1). Они получали бесплатный пероральный прием с парентеральными добавками или без них. Их статус питания был нормальным, они получали препараты, замедляющие транзит, и желудочные антисекреторы. Как здоровые добровольцы, так и пациенты с SBC не получали антибиотики или растворы для очистки толстой кишки в течение 3 месяцев, предшествующих исследованию.

Методы

В Клинический центр поступили здоровые добровольцы и пациенты с SBC. Их поддерживали в течение 3 дней в соответствии с их обычной диетой, которую проанализировал квалифицированный и опытный диетолог. Количество потребляемой энергии, углеводов (СНО), жиров и белков определяли количественно в соответствии с французскими таблицами состава пищевых продуктов (Favier et al., 1995). Стул собирали в течение последних 24 часов и немедленно замораживали при -20 ° C.

Для каждого испытуемого 24-часовой стул размораживали, объединяли и взвешивали. Затем стул разбавляли дистиллированной водой и гомогенизировали на низкой скорости в блендере в течение 5 мин. Фракцию лиофилизировали после подщелачивания NaOH (pH> 9), чтобы предотвратить потерю летучих компонентов (Kien and Liechty, 1987). Измеряли сухой вес, и затем высушенный материал измельчали ​​в мельнице. Бактериальную фракцию выделяли с помощью процедуры фракционирования Стивена и Каммингса (1980a). Вкратце, фракционирование достигалось повторным перемешиванием в стомахере 0.5 г сухого стула в сочетании с формилсалином (0,9% об. / Об. NaCl и 1% об. / Об. Формалин) и лаурилсульфатом натрия (0,1%) с последующей фильтрацией через нейлоновые сетки. Эта процедура дала фракцию крупных частиц, в основном, материала стенок растительных клеток, фракцию мелких частиц, которые также были из стенок растительных клеток, и суспензию бактерий в больших объемах смывов. Бактериальную фракцию центрифугировали при 30 000 г в течение 30 мин, и после удаления супернатанта осадки сушили до постоянного веса лиофилизацией.У каждого испытуемого определение бактериальной фракции в суточном стуле проводилось четыре раза. Внутрииндивидуальный коэффициент вариации был ниже 10%.

Калорийность как стула, так и бактериальной фракции определяли на лиофилизированных аликвотах с помощью калориметрии бомбы (Miller and Payne, 1959).

Аликвоты бактериальной фракции регидратировали в дистиллированной воде и гомогенизировали. Как в бактериальной фракции, так и в свежем стуле определялись жир, азот и короткоцепочечные жирные кислоты (SCFA).У первых двух субъектов химический анализ был проведен до и после обработки ультразвуком (Vibra-Cell, Sonics and Materials Inc., Дамбери, Колорадо, США) свежего стула и бактериальных фракций с целью разрушения бактериальных стенок. Поскольку результаты были примерно сопоставимы, обработка ультразвуком больше не проводилась. Жир был измерен методом Ван де Камера, который дает ~ 100% извлечение длинноцепочечных и среднецепочечных триглицеридов (Van de Kamer et al., 1949). Стул и бактериальные фракции омыляли концентрированным гидроксидом калия (33%) в этаноле, содержащем 0.4% амиловый спирт. При добавлении HCl (25%) к щелочному раствору высвобождались жирные кислоты. Затем добавляли этанол и жирные кислоты экстрагировали петролейным эфиром. Наконец, слой петролейного эфира и жирные кислоты титровали NaOH (0,1 н.), Используя фенолфталеин в качестве индикатора. Общий азот стула и бактериальных фракций определяли пирохемилюминесценцией (Ward et al., 1980) с использованием пирореактора Antek 771C и хемилюминесцентного цифрового детектора азота 720C (Sopares, Gentilly, Франция).КЦЖК также измеряли отдельно в стуле и бактериальных фракциях. Аликвоты гомогенизированного свежего стула и регидратированных бактериальных фракций центрифугировали (1 час при 17 000 g ), супернатант депротеинизировали (10% об. С ортофосфорной кислотой при 5%) и снова центрифугировали при 3000 g в течение 15 мин. КЦЖК измеряли с помощью газожидкостной хроматографии с пламенно-ионизационным детектором (IGC 121 DFL, Intersmat, Courtry, Франция) (Jouany, 1982). В качестве внутреннего стандарта добавляли этилмасляную кислоту.

Расчет и статистический анализ

Для расчета калорийности стула и бактериальных фракций мы использовали коэффициенты пересчета 38,90 и 23,50 кДж / г для жира и белка, соответственно (Саутгейт и Дурнин, 1970). Коэффициенты преобразования калорий для SCFAs составляли 14,52, 20,63 и 24,79 кДж / г для ацетата, пропионата и бутирата соответственно (Blaxter, 1989). Сначала мы предположили, что (а) количество белка равно азоту × 6,25 (коэффициент преобразования азота в белок), и (б) что разница между общими и бактериальными калориями, измеренными калориметрическим методом бомбы, и калориями в жире, белке и SCFAs были равны калориям в CHO.Количество СНО было получено путем деления калорий в СНО на коэффициент преобразования СНО, то есть 17,47 кДж / г (Саутгейт и Дурнин, 1970). Очевидная усвояемость потребленной энергии и питательных веществ была рассчитана следующим образом:

Мы также рассчитали скорректированную кажущуюся усвояемость с учетом калорий, жиров, белков и СНО, выделяемых фекальной бактериальной фракцией:

Результаты выражены в виде средних значений ± s.e.m. Данные у здоровых добровольцев и пациентов с SBC сравнивали с использованием знакового рангового критерия Вилкоксона (парные данные).Данные здоровых добровольцев сравнивались с данными пациентов с SBC с помощью теста Манна – Уитни (непарные сравнения).

Методы оценки усвояемости энергии, аминокислот, фосфора и кальция в кормовых ингредиентах для свиней

Реферат

Правильный состав корма зависит от точной оценки энергетической ценности и содержания питательных веществ в кормовых ингредиентах. Следовательно, перед проведением экспериментов следует тщательно выбирать методологию определения усвояемости энергии и питательных веществ в кормах.Прямая и разностная процедуры широко используются для определения усвояемости энергии и питательных веществ в кормах. Прямая процедура обычно рассматривается, когда исследуемый корм может быть составлен как единственный источник интересующего компонента в исследуемой диете. Однако в некоторых случаях, когда тестовые ингредиенты могут быть составлены только для замены части основного рациона, чтобы обеспечить интересующий компонент, можно применить процедуру различия для получения одинаково надежных значений. В зависимости от представляющих интерес компонентов можно собирать перевариваемый продукт подвздошной кишки или фекалии, а также использовать различные процессы сбора образцов.Например, для аминокислот (АК), чтобы избежать вмешательства в ферментацию в заднем кишечнике, собирают образцы перевариваемой подвздошной кишки для определения перевариваемости подвздошной кишки, и для анализа усвояемости АК обычно используются простые Т-канюля и метод индекса. Что касается энергии, фосфора и кальция, обычно собираются пробы фекалий для определения общей усвояемости тракта, поэтому для получения более точных оценок рекомендуется использовать метод полного сбора. Опасения, связанные с использованием очевидных значений усвояемости, включают различные оценочные значения для разных уровней включения и неаддитивности в смесях кормовых ингредиентов.Эти проблемы можно преодолеть, используя стандартизированную усвояемость или истинную усвояемость, скорректировав эндогенные потери компонентов на основании очевидных значений усвояемости. В этом обзоре обсуждаются методы, используемые для определения усвояемости энергии и питательных веществ у свиней. Предлагается тщательно выбирать методологию на основе интересующего компонента, кормовых ингредиентов и имеющихся экспериментальных возможностей.

Ключевые слова

Усвояемость

Энергия

Питательные вещества

Свиньи

Методы

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

© 2017 Китайская ассоциация зоотехники и ветеринарной медицины.Производство и хостинг компанией Elsevier B.V. от имени KeAi Communications Co., Ltd.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Неточные данные о калориях, эксперты говорят

Людей, которые тщательно проверяют количество калорий на этикетках пищевых продуктов и в меню ресторанов, ждут плохие новости: подсчеты могут быть неверными, говорят эксперты.

Недавние исследования показывают, что количество получаемых людьми калорий влияет на количество получаемых людьми калорий.В некоторых продуктах часть калорий остается «заблокированной» во время пищеварения и не используется организмом. Люди также расходуют часть энергии из пищи, просто переваривая ее; и даже бактерии в кишечнике людей крадут часть калорий из пищи. Ни один из этих факторов не учитывается в нашей нынешней системе подсчета калорий, которая существует более 100 лет назад.

Ученые всегда знали, что подсчет калорий – это всего лишь оценка. И на протяжении многих лет некоторые ученые призывали к изменениям в системе.Теперь исследователи снова привлекли внимание к этой проблеме, заявив, что необходим пересмотр системы подсчета калорий, чтобы потребители имели лучшее представление о том, сколько именно калорий они получают из пищи, которую они едят.

«Если мы собираемся разместить информацию на этикетке пищевых продуктов, было бы хорошо, если бы она была точной», – сказал Дэвид Баер, физиолог-исследователь Центра исследований питания человека Министерства сельского хозяйства США в Белтсвилле, штат Мэриленд. В прошлогоднем исследовании Баер и его коллеги показали, что в миндале на 20 процентов меньше калорий, чем предполагалось ранее.Теперь исследователи рассматривают возможность повторного тестирования других продуктов, включая некоторые виды цельнозерновых и бобовых.

По большей части неточности небольшие, но некоторые продукты могут иметь фактическую калорийность, которая отличается от расчетных значений на целых 50 процентов, говорят эксперты. [См. 9 закусок: полезны или нет?]

Подсчет калорий

Один из способов измерить энергию или калорийность пищи – сжечь ее в устройстве, называемом калориметром-бомбой.Однако этот метод не учитывает тот факт, что люди теряют часть калорий с мочой и калом, а также с теплом. На протяжении многих лет исследователи пытались найти способы объяснить эти потери.

В конце 1800-х и начале 1900-х годов человек по имени Уилбур Этуотер проводил эксперименты, в которых он подсчитывал количество калорий в различных диетах и ​​собирал кал людей, чтобы определить, сколько калорий было потрачено впустую. Основываясь на этих экспериментах, Этуотер пришел к выводу, что белки и углеводы содержат около 4 калорий на грамм, жиры – 9 калорий на грамм, а алкоголь – 7 калорий на грамм.

Эти значения используются и сегодня. Их существование означает, что производители продуктов питания и рестораны могут использовать простую формулу для подсчета калорий в своих продуктах.

Однако эти значения являются приблизительными. Определенные продукты, например продукты с высоким содержанием клетчатки, также не перевариваются, а это означает, что калории, которые мы получаем из них, будут ниже, чем рассчитанные по формуле. В 1970-х годах исследователи ввели модифицированные значения Atwater, которые были предназначены для определенных продуктов, таких как фрукты, овощи и бобы.

Требуются дополнительные изменения

Хотя эти изменения являются хорошим началом, некоторые эксперты говорят, что нам следует сделать больше.

Исследование Рэйчел Кармоди, научного сотрудника Центра системной биологии Гарвардского университета в Кембридже, штат Массачусетс, и ее коллег, показывает, что обработка пищевых продуктов – например, употребление в пищу протертой, а не цельной моркови – изменяет калории, которые мы получаем из Это.

Пищевая промышленность берет на себя часть работы пищеварения, сказал Кармоди, а это означает, что обычно обработанная пища будет содержать больше калорий, чем необработанная.

калорий в обработанных пищевых продуктах, вероятно, близки к значениям, которые оценивает система Атуотера. Например, если вы едите картофельное пюре, которое, по расчетам системы Атуотера, содержит 300 калорий, вы, вероятно, получаете большую часть этих калорий, сказал Кармоди. . Но если вы съедите целый необработанный картофель такого же размера, вы получите около 200 калорий, сказала она.

По словам Кармоди, разница больше всего для крахмалистых продуктов, таких как картофель, и меньше всего для мяса. (По ее словам, количество калорий в необработанном и обработанном мясе различается всего на 5-10 процентов.)

Система Atwater также не учитывает структурные различия в пище, которые делают некоторые калории недоступными для нашего организма. Например, исследование миндаля, которое также учитывало потерю калорий с фекалиями, показало, что часть жира в цельном миндале заперта в структуре, которую наш организм не может переварить. В то время как система Atwater утверждает, что порция цельного миндаля содержит около 170 калорий, исследование миндаля показало, что на самом деле она содержит около 130.

«Учитывая, что система Atwater обрабатывает практически все продукты одинаково, у нас нет хорошей перспективы, когда Пришло время сделать выбор в отношении диеты », – сказал Кармоди.

Когда мы перевариваем пищу, мы также выделяем энергию в виде тепла. Количество излучаемого нами тепла зависит от конкретных компонентов пищи. Что касается белков, это от 20 до 30 процентов калорий в пище, поэтому, если мы съедим 100 калорий белка, мы получим из него около 80 калорий, – сказал Кармоди. По ее словам, для жиров это намного меньше, примерно от 0 до 3 процентов. (Таким образом, если мы съедим жир на 100 калорий, мы получим 97 из этих калорий.)

В этом месяце Кармоди и его коллеги выступят с презентацией на ежегодном собрании Американской ассоциации содействия развитию науки в Бостоне. обсудить способы улучшения системы подсчета калорий.

Имеет ли значение для талии?

Некоторые исследователи говорят, что в целом неточности в подсчетах калорий не имеют большого значения. «Я думаю, что они достаточно хороши для большинства целей», – сказал Малден Несхайм, почетный профессор питания Корнельского университета в Итаке, штат Нью-Йорк, и соавтор книги «Почему калории считаются» (University of California Press, 2012 ).

Люди обычно едят самые разные продукты, а не только миндаль или крахмал. Таким образом, переоценка или недооценка калорий в одном конкретном продукте, вероятно, не окажет большого влияния на ежедневное потребление калорий, сказал Несхайм.

И вообще, упущения в системе Atwater, как правило, приводят к завышению оценок, что означает, что они, вероятно, не помешают потере веса.

«Это будет проблемой только для людей, которые хотят набрать вес», – сказала Мэри Эллен Камир, профессор факультета пищевых наук и питания человека в Ороно Университета штата Мэн.

Но другие исследователи говорят, что цель пересмотра – дать людям как можно больше точной информации, чтобы помочь им сделать осознанный выбор в отношении еды, сказал Кармоди.Такой процесс может привести к широким изменениям, например к новым цифрам общего количества калорий, необходимых людям в день.

«Получив лучшее представление об эффективных калориях в пище, мы получим лучшее представление о потребностях человека в энергии», – сказал Кармоди.

Изменить систему калорий будет непросто, сказал Кармоди. А из-за различий между людьми было бы невозможно создать систему, которая работала бы для всех.

Но исследователи могут заполнить некоторые из самых больших пробелов в системе, такие как эффекты обработки пищевых продуктов и потери тепла, сказал Кармоди.

«Мы можем начать думать о простых способах улучшения [системы], которые будут лучше для среднего потребителя», – сказал Кармоди.

Передайте: Требуется капитальный ремонт системы, которую мы используем для подсчета калорий, чтобы люди могли лучше оценивать, сколько калорий они получают с пищей.

Следуйте за Рэйчел Реттнер в Twitter @RachaelRettner или MyHealthNewsDaily @MyHealth_MHND . Мы также на Facebook и Google+ .

Вот как 8 различных планов похудания повлияют на ваши корма

То, что вы вкладываете в свое тело, влияет на то, что выходит (да). Поэтому неудивительно, что смена диеты может привести к большим изменениям в работе кишечника. Среди других планов питания, вегетарианство, употребление Whole30 или эксперименты с кетогенной диетой могут повлиять на ваше число двоек.

«Какашки в основном состоят из воды, – говорит Никет Сонпал, доктор медицины, доцент медицинского колледжа Туро в Нью-Йорке.«Остальное – это клетчатка, бактерии, слизь и клетки. Так что, в конце концов, то, как диета влияет на фекалии, на самом деле зависит от клетчатки ».

Итак, как именно вы можете ожидать, что ваши привычки какать изменятся в зависимости от вашего плана здорового питания? Ниже мы рассмотрим смены диеты, которые могут привести к необычной активности.

Давайте нырнем.

Шерил Селигман

Отказ от мяса – отличный способ стать регулярным, – говорит Сонпал.Вегетарианцы, как правило, имеют гораздо более регулярный график какашек по сравнению с их плотоядными коллегами, потому что их фруктовые и овощные диеты содержат большое количество клетчатки. «Любая диета, основанная на большом количестве растений, будет иметь более регулярные, объемные испражнения – подумайте о более мягком и более мягком стуле», – говорит он. И это отличные новости для твоего тела!

Шерил Селигман

Точно так же, как вегетарианство, переход на веганство, вероятно, будет означать более мягкие и регулярные какашки, – говорит Сонпал.А если вы перейдете на новый уровень, отказавшись от молочных продуктов, ваше время на фарфоровом троне может пройти еще более гладко. «Отказ от молочных продуктов приведет к учащению испражнений и, вероятно, у вас будет меньше газов», – говорит Сонпал. Это особенно верно, если у вас проблемы с лактозой.

Связанный: «Я пил цельное молоко вместо миндального в течение месяца – вот что случилось»

Шерил Селигман

Кетогенная диета, которая делает упор на белки и жиры и снижает количество углеводов до 40 граммов в день (максимум), немного противоречива.Хотя вы, возможно, сможете похудеть, заставив свое тело сжигать запасы жира для получения энергии вместо углеводов (он же кетоз), ваше расписание ванной может сильно пострадать. «Обычно это приводит к диарее или, в некоторых случаях, запору», – говорит он. «Это, как правило, диарея, потому что вы не принимаете достаточное количество наполнителей, таких как клетчатка». Ожидайте редких жидких какашек.

Узнайте о самых странных тенденциях похудания в истории:

Шерил Селигман

Подобно кето-диете (но менее экстремально), диета Аткинса делает упор на белки, а не на углеводы.«Пока вы едите много овощей, у вас будут довольно приличные движения миски», – говорит Сонпал. «Но у вас возникают проблемы, когда вы едите слишком много белка и не получаете достаточного количества пробиотиков или клетчатки». Если это так, ожидайте, что количество посещений дворца помад уменьшится.

Связанный: Какая диета с высоким содержанием белка лучше: Аткинс, Дюкан или кетогенный?

Шерил Селигман

Палео-план питания учитывает любое мясо, которое вы можете съесть, но увлечение означает, что вы можете серьезно подкрепиться, говорит Сонпал.«Мясо переваривается дольше, а это значит, что у вас могут возникнуть запоры», – говорит он. Читайте: тяжелее, реже походы в туалет. «Если вы сбалансируете это с большим количеством фруктов и овощей, все будет в порядке», – добавляет он.

(Узнайте, как костный бульон может помочь вам похудеть с помощью диеты на костном бульоне Women’s Health).

Шерил Селигман

Чистое питание с Whole30 поможет вам сбросить лишние килограммы и научит вас какать на профессиональном уровне.«У людей, которые не едят много полуфабрикатов, стул будет более естественным, – говорит Сонпал. Это связано с тем, что многие консерванты и жевательные резинки, которые они добавляют в пищу, имеют тенденцию к перевязке кишечника. Таким образом, отсутствие консервантов и излишек цельных продуктов, таких как фрукты и овощи, заставят вас чувствовать себя намного лучше в ванной.

По теме: 7 женщин рассказывают, как они похудели, не считая ни единой калории

Шерил Селигман

«Мы называем это диетой Costco», – говорит Сонпал.«Много еды по низкой цене». Эта стратегия похудания может быть реализована двумя способами в ванной. Если вы едите большие салаты, это означает, что вам нужно много клетчатки. Здравствуйте, легкие походы в ванную. Если вы едите суп, который может не содержать много клетчатки, вы, скорее всего, заметите, что привычки в ванной похожи на очищение. Это означает, что сначала у вас будут нормальные какашки, но через некоторое время вы начнете замечать более мелкие и более жидкие движения, – говорит он. Сделайте себе одолжение и выберите первый вариант.

Шерил Селигман

«Это, вероятно, самая здоровая из всех диет с точки зрения калорий, удовлетворения и здоровья какашек», – говорит Сонпал. При правильном балансе жиров и овощей с клетчаткой вы можете рассчитывать на идеальные какашки на рег. «Кроме того, некоторые из специй, которые часто встречаются в этой диете, например, перец чили, на самом деле способствуют хорошему опорожнению кишечника», – говорит Сонпал.

Какой бы план питания вы ни выбрали, обязательно выбирайте фрукты и овощи, богатые клетчаткой.А если вы придерживаетесь низкоуглеводной диеты, следите за потреблением клетчатки, чтобы вы получали не менее 25 граммов клетчатки в день (через цельные продукты или добавки).

Этот контент создается и поддерживается третьей стороной и импортируется на эту страницу, чтобы помочь пользователям указать свои адреса электронной почты. Вы можете найти больше информации об этом и подобном контенте на сайте piano.io.

Сравнение фекальной микробиоты у детей с расстройствами аутистического спектра и нейротипичных братьев и сестер в коллекции Simons Simplex

Abstract

Чтобы оценить потенциальную связь между фенотипом расстройства аутистического спектра (РАС), функциональными расстройствами желудочно-кишечного тракта и фекальной микробиотой, мы набрали симплексные семьи, которые имели только одного пробанда РАС и нейротипичных (NT) братьев и сестер, через Simons Simplex Community. в Интерактивной сети аутизма (SSC @ IAN).Образцы кала и метаданные, относящиеся к функциональным расстройствам желудочно-кишечного тракта и диете, были собраны у пробандов с РАС и NT братьев и сестер пробандов с РАС (возраст 7–14). Функциональные желудочно-кишечные расстройства (FGID) оценивались с использованием заполненного родителями вопросника ROME III для педиатрических FGID, а проблемное поведение – с помощью Контрольного списка поведения ребенка (CBCL). Целевые количественные анализы полимеразной цепной реакции (кПЦР) проводили для выбранных таксонов, участвующих в РАС, включая Sutterella spp ., Bacteroidetes spp . и Prevotella spp . Секвенирование участков V1V2 и V1V3 бактериальных генов 16S рРНК из фекальной ДНК компанией Illumina было выполнено со средней глубиной 208000 и 107000 считываний высокого качества соответственно. Двадцать пять из 59 детей с РАС и 13 из 44 братьев и сестер с NT соответствовали критериям ROME III по крайней мере для одного FGID. Функциональные запоры чаще встречались у пациентов с РАС (17 из 59), чем у братьев и сестер с NT (6 из 44, P = 0,035). Средние показатели CBCL у NT братьев и сестер с FGID, у детей с ASD с FGID и ASD без FGID были сравнительно выше (58–62 vs.44, P <0,0001) по сравнению с детьми с NT без FGID. Не было существенной разницы в потреблении макроэлементов между братьями и сестрами с ASD и NT. Не было значительных различий в оценке степени тяжести РАС между детьми с РАС с FGID и без них. Не было обнаружено значительных различий в разнообразии или общем микробном составе между детьми с РАС с NT братьями и сестрами. Однако исследовательский анализ данных секвенирования 16S рРНК выявил несколько таксонов с низкой численностью, сгруппированных на уровне родов, которые были связаны с взаимодействиями ASD и / или первого порядка ASD * FGID (FDR <0.1).

Образец цитирования: Son JS, Zheng LJ, Rowehl LM, Tian X, Zhang Y, Zhu W и др. (2015) Сравнение фекальной микробиоты у детей с расстройствами аутистического спектра и нейротипичных братьев и сестер в коллекции Simons Simplex. PLoS ONE 10 (10): e0137725. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137725

Редактор: Маркус М. Хеймсаат, Шарите, кампус Бенджамина Франклина, ГЕРМАНИЯ

Поступила: 29 мая 2015 г .; Принята к печати: 21 августа 2015 г .; Опубликован: 1 октября 2015 г.

Авторские права: © 2015 Son et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника

Доступность данных: Демультиплексированные, парные конечные последовательности данные были депонированы в NCBI Short Read Archive под регистрационным номером биопроекта: PRJNA282013 (www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA2282203).

Финансирование: Эта работа была поддержана Инициативой исследования аутизма Фонда Саймонса, грант № 239729 Э.Л. (https://sfari.org/). Спонсор играл роль в дизайне исследования, так как участники исследования были из сообщества Simons Simplex в Interactive Autism Network, но в остальном не играли никакой роли в других аспектах дизайна исследования, сбора и анализа данных, решения о публикации или подготовки. рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Расстройства аутистического спектра (РАС) – это нарушения развития нервной системы, характеризующиеся в первую очередь изменениями во взаимных социальных взаимодействиях и общении, а также повторяющимся поведением.Сообщаемая распространенность РАС увеличилась и затрагивает 1 из 68 детей в США [1]. Частично это может быть связано с повышенным вниманием к этим расстройствам [2,3]. Диагноз РАС ставится на основании результатов специально обученных врачей и психологов, которые проводят поведенческие оценки, связанные с аутизмом. Исследования близнецов подтверждают вклад как генетических, так и экологических факторов в патогенез РАС [2,3].

Об изменениях в составе постоянно проживающих в кишечнике микробных сообществ сообщалось при увеличивающемся числе заболеваний человека, включая РАС и функциональные расстройства желудочно-кишечного тракта (FGID) [4–24].Термин «функциональный» в FGID относится к отсутствию структурных аномалий в кишечнике, которые могут быть идентифицированы с помощью крови, рентгенографических или эндоскопических тестов [25,26]. Следовательно, FGID диагностируются на основе оценки симптомов желудочно-кишечного тракта и исключения других заболеваний желудочно-кишечного тракта (например, целиакии, воспалительных заболеваний кишечника). FGID очень распространены среди населения в целом и составляют основную часть гастроэнтерологии и практики первичной медико-санитарной помощи. Нарушения нервной регуляции функции кишечника и чувствительности участвуют в патогенезе FGID [20,25,26].

Функциональные симптомы со стороны желудочно-кишечного тракта часто описываются у детей с РАС как неневрологические сопутствующие заболевания [27–31]. Однако серьезным препятствием для интеграции исследований симптомов РАС с исследованиями желудочно-кишечного тракта с исследованиями, проводимыми в общей популяции, было то, что инструменты, используемые для оценки функциональных симптомов желудочно-кишечного тракта при РАС, отличались от процесса ROME III, который является текущим международным стандартом, согласно которому функциональные расстройства желудочно-кишечного тракта (FGID) диагностируются и классифицируются [24].

В 2010 году Инициатива по исследованию аутизма при Фонде Саймонса (SFARI) приступила к созданию коллекции Simons Simplex Collection (SSC) в качестве ресурса для исследований РАС [32].SSC включает более 2000 симплексных семей, каждая с одним пробандом с РАС, но с незатронутыми родителями, братьями и сестрами. Симплексные семьи набирались через 12 исследовательских клиник при университетах, расположенных в Канаде и США. После набора в SSC пробанды ASD (возраст 4–18) были оценены с помощью обширного набора диагностических мер, включая График наблюдения за аутизмом (ADOS), с использованием одинаковых диагностических критериев в разных центрах. Медицинские данные, включая симптомы со стороны желудочно-кишечного тракта, были собраны у пробандов с РАС, но не у братьев и сестер с NT, с использованием обширной формы истории болезни SSC.Семьи исключались, если пробанд не соответствовал критериям РАС, имел значимые с медицинской точки зрения перинатальные инциденты (например, перинатальную асфиксию), низкий умственный возраст или имел основных родственников в спектре аутизма. Таким образом, SSC представляет собой «уникальную, хорошо описанную выборку способных детей и подростков с относительно тяжелыми расстройствами аутистического спектра, как показано ADI-R и ADOS Calibrated Severity Scores (ADOS-CSS)» [32]. Чтобы оценить связь между фенотипом РАС, FGID и фекальной микробиотой, мы набрали подмножество семей SSC с пробандами РАС и / или братьями и сестрами NT (возраст 7–14 лет) для участия в исследовании по сбору образцов кала и метаданных, связанных с функциональные расстройства желудочно-кишечного тракта и диета.

Материалы и методы

Набор пациентов

семей были набраны через реестр под названием Simons Simplex Community через Интерактивную сеть по аутизму (SSC @ IAN), которая состоит из симплексных семей, первоначально набранных в Simons Simplex Collection, которые были готовы связаться через Интерактивную сеть по аутизму для дополнительных исследований. . SSC @ IAN предоставил нам контактную информацию о 245 потенциально подходящих симплексных семьях, которые выразили готовность связаться с нами по поводу этого исследования.Из 245 потенциально подходящих семей SSC с 339 детьми 107 семей со 145 детьми дали согласие на участие с письменным согласием родителей и письменным согласием детей для всех участвовавших детей, а 66 семей со 103 детьми (66 пробандов ASD и 37 NT братьев и сестер) завершили исследование. . Критериями исключения для пробандов с РАС и NT братьев и сестер в этом исследовании были возраст <7 или возраст> 14 лет, прошлые или текущие заболевания желудочно-кишечного тракта или другие серьезные медицинские проблемы, а также использование антибиотиков в течение одного месяца после сбора образца стула.Процедуры настоящего исследования были рассмотрены и одобрены институциональным наблюдательным советом Университета Стоуни-Брук (IRB 313466)

Семьям, которые согласились участвовать в исследовании, было предложено заполнить Педиатрическую версию ROME III (QPGS-RIII), форму симптомов желудочно-кишечного тракта в истории болезни Simon Simplex Collection (версия 4.0) [31], Контрольный список поведения детей (CBCL / 6–18) [33–37], недельный дневник питания для пробанда с РАС и / или брата или сестры с NT до взятия пробы кала, а также предоставить текущую информацию о росте и весе ребенка.Семьи попросили сдать образцы стула после того, как испытуемые не принимали пробиотики и антибиотики в течение как минимум одного месяца.

Педиатрический процесс ROME III по диагностике FGID и раздел симптомов желудочно-кишечного тракта в анамнезе SSC

Функциональные расстройства желудочно-кишечного тракта (FGID) оценивались с использованием процесса ROME III [25]. Информация о симптомах желудочно-кишечного тракта у братьев и сестер с РАС и NT также была собрана с использованием раздела «Симптомы желудочно-кишечного тракта» формы SSC Medical History [32]. Раздел GI-симптомы формы SSC Medical History включал семь категорий симптомов: запор, диарея, ненормальный запах стула, вздутие живота, чрезмерное газообразование, сильная боль в животе и рвота.Родителей попросили оценить, являются ли эти категории проблемными, на «да», «не уверен» и «нет». Многие из этих категорий симптомов в форме SSC перекрываются со следующими симптомами, включенными в расчет индекса тяжести ЖКТ [27]: запор, диарея, запах стула, метеоризм и боль в животе, но не включают «необъяснимую дневную раздражительность», «Ночное пробуждение» или «болезненность живота во время осмотра».

Контрольный список поведения детей (CBCL)

CBCL / 6-18 – это форма отчета родителей для выявления эмоциональных, поведенческих и социальных проблем у детей в возрасте 6–18 лет [33].Этот инструмент, как и более ранняя версия этого инструмента, ранее использовался несколькими исследовательскими группами, изучающими детей школьного возраста с РАС [34–37]. Данные от братьев и сестер с ASD и NT были введены и проанализированы с помощью AGES 6–18 ASEBA-PC MODULE (ASEBA), чтобы получить T-баллы, привязанные к норме (M = 50, SD = 10). CBCL содержит восемь шкал синдромов: тревожный / депрессивный, отстраненный / депрессивный, соматические жалобы, нарушение правил, агрессивное поведение. Шкала интернализирующей области является мерой эмоциональных проблем и содержит три шкалы синдромов: тревога / депрессия, отстраненность / депрессия и соматические жалобы.Оценка внешнего домена является мерой поведенческих проблем и содержит шкалы поведения при нарушении правил и синдрома агрессивного поведения.

Диетическая информация

Родителей попросили записывать ежедневное потребление пищи братьями и сестрами с РАС и NT в дневник питания / подсчет калорий Департамента педиатрии Медицинского центра Университета Стони Брук в течение 7 дней до взятия образца стула. Данные были введены и проанализированы с использованием программного обеспечения для анализа питательных веществ Nutritionist Pro версии 5.2.0 (Axxya Systems, диетолог Pro, Стаффорд, Техас). Мы сосредоточились на анализе следующих шести категорий макроэлементов: общее количество ккал / день, общий белок г / день, общие углеводы г / день, общий жир г / день, общее количество пищевых волокон в день, общий сахар г / день.

Сбор образцов кала и выделение ДНК

Образцы фекалий были собраны в «шляпку» стула, помещенную в унитаз, и после опорожнения 2 мл стула были немедленно перенесены с помощью ложки, встроенной в крышку, во флакон Para-Pak Clean (Meridian Bioscience, Цинциннати, Огайо), содержащий 10 мл RNAlater для метагеномных исследований и флакон Para-Pak Clean без консерванта.Образцы фекалий были отправлены в нашу лабораторию в холодильниках на ночь. Фекальную ДНК экстрагировали из образцов стула сразу по прибытии с использованием ZR Fecal DNA MiniPre (Zymo Research Corporation, Ирвин, Калифорния) и следуя протоколу производителя. Образцы фекальной ДНК и стула хранили при -80 ° C.

Количественная ПЦР (qPCR) для целевых бактериальных подгрупп

QPCR-анализов проводили с использованием установленных праймеров для всех бактерий (прямой, 5′-GTG STG CAY GGY TGT CGT CA-3 ‘и обратный 5′-ACG TCR TCC MCA CCT TCC TC-3’) [38], Sutterella подгруппа ( прямая, 5′-CGC GAA AAA CCT TAC CTA GCC-3 ‘и обратная 5′-GAC GTG TGA GGC CCT AGC C-3’) [10], подгруппа Bacteroidetes (прямая 5′-AACGCTAGCTACAGGCTT- 3 ‘и обратный 5′-CCAATGTGGGGACCTTC-3’) [39]; Prevotella (прямой, 5’-CACCAAGGCGACGATCA-3 ’и обратный 5’-GGATAACGCYGGACCT-3’) [40], C . коккоиды-E . rectales, подгруппа (прямая, 5′-CGGTACCTGACTAAGAAGC-3 ‘и обратная 5′-AGTTT (C / T) ATTCTTGCGAACG-3’) [41], Faecalibacterium prausnitzii (прямая 5′-CCC TTC AGT GCC GCA GT- 3 ‘и обратный 5′-GTC GCA GGA TGT CAA GAC-3’) [42], подгруппа Escherichia coli (прямая, 5′-GTT AAT ACC TTT GCT CAT TGA-3 ‘и обратная, 5’-ACC AGG GTA TCT AAT CCT GTT-3 ‘) [42]. Преобразование log ₂ относительной численности каждой бактериальной подгруппы измеряли с помощью ΔCt = Ct (пороговый цикл) _{, всего бактерий} -Ct _{подгруппы} .Все анализы проводили в трех экземплярах. Стандарты количественного определения плазмид были приготовлены из репрезентативных клонов целевых организмов, чтобы гарантировать, что анализы проводились в линейном диапазоне и с аналогичными наклонами.

Конструирование библиотеки ампликонов 16S рРНК и анализ секвенирования Illumina V1V2 и V1V3

Бактериальные профили в фекалиях определяли с использованием широкой амплификации вариабельной области V1V2 длиной ~ 300 пар оснований (п.н.) с использованием праймеров 27FYM (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) и 338R (TGCTGCCTCCCGTAGGAGT) и области V1V3 и 5,5 п.н. ATTACCGCGGCKGCTGG) [43,44].Секвенирование выполняли на платформе Illumina MiSeq с использованием наборов реагентов версии 3 на 600 циклов. Данные демультиплексированных парных концевых последовательностей были депонированы в NCBI Short Read Archive под регистрационным номером биопроекта: PRJNA282013 (www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA2282203). Отсортированные парные чтения были собраны с использованием phrap [45], а парные чтения, которые не были собраны, были отброшены. Концы собранных последовательностей обрезали по движущемуся окну из 5 нуклеотидов до тех пор, пока среднее качество не достигло или не превысило 20.Обрезанные контиги с неоднозначностью более 1 или короче 200 нуклеотидов отбрасывали. Потенциальные химеры, идентифицированные с помощью Uchime (usearch6.0.203_i86linux32) [46] с использованием эталонных последовательностей Schloss [47] Silva, были удалены из последующих анализов. Собранные последовательности были выровнены и классифицированы с помощью SINA (1.2.11) с использованием 418 497 бактериальных последовательностей в Silva 115NR99 в качестве эталона, сконфигурированного для получения таксономии Silva [48,49]. Оперативные таксономические единицы (OTU) были получены путем кластеризации последовательностей с идентичными таксономическими назначениями.Количество OTU нормализовали между образцами путем деления количества последовательностей на общее количество последовательностей, сгенерированных на образец, для расчета относительной численности. Таблицы OTU уровня филумов были сгенерированы путем сворачивания OTU более низкого уровня в категории более высокого уровня. Отбирались OTU с максимальной относительной численностью <0,0001 и распространенностью <0,01. Остальные относительные содержания OTU были затем преобразованы с использованием функции квадратного корня.

Статистический анализ

Сравнение пола, FGID и SSC GI-симптомов у братьев и сестер с ASD и NT проводилось с использованием безусловного точного критерия Фишера с одним хвостом [50].Пороговая значимость была установлена ​​на уровне P <0,05.

Братья и сестры ASD и NT были дополнительно подразделены на предмет наличия у них диагноза FGID на основе процесса ROME III. Характеристики исследования, включая индекс массы тела (ИМТ), баллы CBCL, показатели питания и показатели qPCR ΔCt, сравнивались между следующими четырьмя группами: 1) ASD с FGID, 2) ASD без FGID, 3) NT братьев и сестер с FGID и 4) NT братья и сестры без FGID. Переменные результата, включая CBCL, диетические макроэлементы, qPCR ΔCt, также были смоделированы с использованием моделей смешанных эффектов с ASD, FGID и ASD * FGID в качестве трех фиксированных эффектов и семьи в качестве случайных эффектов.Каждая непрерывная переменная была адаптирована к линейной модели, а каждая категориальная переменная была адаптирована к логистической модели. Сравнение непрерывных переменных между подобранными по семейному признаку ASD и NT братьями и сестрами проводилось с использованием двустороннего Т-критерия Стьюдента или знакового рангового критерия Вилкоксона с порогом значимости, установленным как P <0,05.

индексов альфа-разнообразия (например, Chao1, сложность Шеннона H, четность Шеннона H / Ho) были рассчитаны с использованием Explicet [51] для каждой из четырех групп с 10 000 повторных повторных выборок: 1) ASD с FGID, 2) ASD без FGID, 3) Братья и сестры NT с FGID и 4) братья и сестры NT без FGID.

Бета-разнообразие сравнивали у ASD и NT сибсов с использованием функции adonis в пакете R vegan, как описано ранее [52,53] на уровне филы, семьи и рода. Эта функция использует непараметрический многомерный дисперсионный анализ (PERMANOVA) [54] и применялась с использованием индексов Брея-Кертиса, Жаккара и Мориситы-Хорна в качестве измерения расстояния [55]. Семья (т.е. принадлежат ли братья и сестры ASD или NT к одному и тому же семейству) была выбрана в качестве переменной страты для ограничения перестановок, как описано ранее [56].Общий микробный состав, объединенный по типам, также сравнивался между подобранными по семейству ASD и NT братьями и сестрами с использованием перестановочного Т-теста Хотеллинга [57].

Парные сравнения двух классов преобразованных (квадратный корень) относительной численности отдельных OTU (на уровне типов и родов) между пробандами с РАС и NT братьями и сестрами из одного и того же семейства были проведены с использованием знакового рангового критерия Вилкоксона с пороговым значением, установленным как FDR <0,05.

Поскольку в данных подсчета последовательностей микробиома часто наблюдается избыточная дисперсия [58], модель отрицательной биномиальной регрессии также использовалась для оценки влияния фенотипа ASD, фенотипа FGID и взаимодействий первого порядка между ASD и FGID (ASD * FGID) на каждая отдельная OTU как в парных, так и в непарных выборках ASD и NT следующим образом: где Y _ijk обозначает количество исходных последовательностей OTU k для дочернего элемента j в семье i.В этой модели мы рассматриваем семью, которая может отражать генетические и, возможно, диетические факторы, как случайный коэффициент с нулевым средним. Коэффициенты b ₀ , β ₁ , β ₂ и β ₃ являются фиксированными константами, представляющими большое среднее значение, эффект ASD, FGID и взаимодействие ASD и FGID соответственно. Общее количество последовательностей в журнале () для каждого отдельного человека считается смещением. Поскольку распределение количества необработанных последовательностей часто искажается из-за большой доли нулевых значений, версия отрицательной биномиальной модели с нулевым раздутием была также адаптирована к каждой отдельной OTU: окончательная модель была выбрана на основе информационного критерия Акаике (AIC). ).Значения p для каждой OTU были скорректированы для множественных сравнений для расчета коэффициента ложного обнаружения (FDR) с использованием процедуры Бенджамини-Хохберга [59]. Порог значимости для взаимодействий первого порядка ASD, FGID или ASD * FGID был установлен на уровне FDR <0,1. Логистическая и линейная смешанные модели были построены с помощью пакета R glmmADMB [60] и lme4-R [61] соответственно.

Сравнительный анализ измерений относительной численности с преобразованием параллельного квадратного корня [62] типов Bacteroidetes, рода Sutterella и рода Prevotella с помощью MiSeq V1V2, MiSeq V1V3 и целевой КПЦР был проведен с использованием моделирования скрытого структурного уравнения [63].Из-за большой доли нулевых счетчиков для родов Sutterella и Provetella образцы с нулевым счетом были исключены из анализа. Чтобы избежать осложнений, вызванных коррелированными выборками, модели SEM были оснащены группирующей переменной ASD и ограничением, что нагрузки одинаковы для разных групп. Соответствующая модель для каждой группы: Соответствующая модель для каждой группы: Здесь ξ _ij – истинная относительная численность бактерий в шкале квадратного корня, а δ ₁ , δ ₂ и δ ₃ – соответствующие ошибки измерения.Чтобы сделать модель идентифицируемой, мы выбрали кПЦР в качестве опорного уровня с a ₁ = 0 и b ₁ = 1. Модель была оснащена пакетом R lavaan [64].

Результаты

Демографические и функциональные расстройства желудочно-кишечного тракта (FGID) у братьев и сестер с РАС и NT

Всего 59 детей с РАС и 44 брата и сестры из 66 семей завершили исследование ( Таблица 1) . Подходящие пары братьев и сестер с РАС и NT были из 37 семей.В некоторых случаях были набраны NT братьев и сестер пробандов с РАС, но не пробандов с РАС, потому что их возраст превышал 14 лет. Дети с РАС были преимущественно мужчинами. Гендерное распределение братьев и сестер NT было примерно одинаковым. Средний возраст как детей с РАС, так и братьев и сестер с NT составлял 10 лет, и они были преимущественно европеоидного происхождения. Существует три основные группы FGID (см. , Таблица 1, ) [24]: h2) Рвота и аэрофагия, h3). FGID, связанные с болью в животе, и h4) Запор и недержание кала.Группа h2 далее подразделяется на три FGID: h2a) синдром подросткового руминации; h2b) синдром циклической рвоты; h2c) Аэрофагия. Группа h3 далее подразделяется на четыре FGIDS: h3a) функциональная диспепсия, h3b) синдром раздраженного кишечника (IBS), h3c) абдоминальная мигрень, h3d) детская функциональная боль в животе с подмножеством, обозначенным как h3d1. Детский функциональный болевой синдром в животе. Субъекты, отнесенные к подгруппе h3d1, имеют дополнительные соматические симптомы, такие как головная боль, боль в конечностях или трудности со сном.

Таблица 1. Демографические и функциональные расстройства желудочно-кишечного тракта (FGID) у братьев и сестер с РАС и NT.

Характеристики исследования братьев и сестер ASD и NT перечислены ниже. Для категориальных переменных проценты показаны в скобках (). Для непрерывных переменных указано среднее значение ± стандартное отклонение.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137725.t001

У 25 из 59 (42%) детей с РАС и 13 из 44 (30%) братьев и сестер с NT был диагностирован хотя бы один FGID.Пятнадцать детей с РАС и 13 братьев и сестер с NT в 37 семьях соответствовали критериям ROME III по крайней мере для одного FGID, с соответствием для FGID в 6 (18%) парах братьев и сестер ASD / NT. У некоторых братьев и сестер с ASD и NT было диагностировано более одного FGID. Дети с РАС имели более высокую распространенность функционального запора по сравнению с NT братьями и сестрами (P = 0,035), когда в анализ были включены как совпадающие, так и несоответствующие индивидуумы. Мы не обнаружили существенной разницы в распространенности детей с хотя бы одним FGID в семейных парах братьев и сестер с ASD / NT.Мы также не обнаружили существенной разницы в распространенности конкретных FGID, таких как функциональный запор, в семейных парах братьев и сестер ASD / NT.

Когда был создан регистр SSC, формы истории болезни, включая форму о симптомах со стороны желудочно-кишечного тракта, заполнялись родителями детей с РАС, но не братьями и сестрами с NT. Та же самая форма симптомов SSC GI была затем заполнена (~ 2–3 года спустя) родителями детей с РАС и NT для текущего исследования. Как показано в Таблице 2 , не наблюдалось значительных изменений в распространенности желудочно-кишечных симптомов с течением времени.Кроме того, результаты SSC показывают, что у детей с РАС более высокая распространенность запоров по сравнению с NT братьями и сестрами (P = 0,05).

Таблица 2. Результаты SSC проблемных желудочно-кишечных симптомов.

Предыдущий и текущий процент детей с РАС и братьев и сестер с NT, имеющих проблемный желудочно-кишечный симптом, указан ниже. Предыдущий процент был основан на ответах родителей на медицинскую форму SSC для детей с РАС только при первой регистрации в реестре SSC. Текущий процент основан на ответах родителей на одни и те же формы как для ASD, так и для NT братьев и сестер в ходе текущего исследования ~ 2-3 года спустя.P-значения отражают сравнение текущих ответов братьев и сестер с ASD и NT. Не было значительных изменений в распространенности любого из семи проблемных желудочно-кишечных симптомов у детей с РАС в эти две временные точки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137725.t002

Сравнение потребления CBCL и макроэлементов

Как показано в таблице 3 и таблице S1 , оценка тяжести РАС, ADOS-CSS, существенно не различалась между группой ASD с FGID и группой ASD без FGID.Средние общие, интернализующие, экстернализирующие и субшкальные баллы CBCL были значительно увеличены (p <0,05) у детей с РАС как в парах братьев и сестер с РАС / NT, так и по сравнению со всеми детьми с РАС с NT (совпадающими и несогласованными). Эти показатели CBCL также были значительно увеличены (p <0,05) у NT братьев и сестер с FGID по сравнению с NT братьями и сестрами без FGID ( Таблица 3 ). Не было существенной разницы в средних показателях CBCL между детьми с РАС с FGID по сравнению с детьми с ASD без FGID.

Таблица 3. Сравнение показателей ADOS-CSS, CBCL и потребления макроэлементов у детей с РАС с FGID, детей с ASD без FGID, братьев и сестер NT с FGID и братьев и сестер NT без FGID.

Для непрерывных переменных перечислены средние значения ± стандартное отклонение. N.A., не доступен.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137725.t003

Нет значимых различий (p <0,05) между четырьмя исследуемыми группами в отношении ежедневного потребления макроэлементов (калорий, белков, жиров, углеводов, сахаров или пищевые волокна) (, таблица 3, ).Сообщалось, что только 4 ребенка придерживались диеты без глютена и / или казеина. Участники исследования имели ИМТ в пределах нормы и не страдали ожирением.

В целевых бактериальных подгруппах не обнаружено ассоциаций (FDR

Целевые количественные ПЦР анализы образцов кала были проведены для подгрупп Sutterella , Prevotella и всего Bacteroidetes , поскольку в предыдущих отчетах относительная численность этих подгрупп различалась у детей с РАС и NT [7,8,10–14] .QPCR-тесты, нацеленные на C . coccoides-E-rectales group, Faecalibacterium prausnitzii и Escherichia coli также были выполнены, поскольку ранее сообщалось об изменении относительной численности при желудочно-кишечных расстройствах, таких как воспалительные заболевания кишечника [23]. Средние значения ΔCt этих подгрупп, которые представляют собой преобразование log ₂ относительной численности, для 1) ASD с FGID, 2) ASD без FGID, 3) NT с FGID и 4) NT без FGID, являются показано в Таблице 4 .Никаких существенных различий не наблюдалось ни для одной из этих бактериальных подгрупп в 37 парах братьев и сестер ASD / NT (см. Методы). Кроме того, в смешанных моделях не наблюдалось значительного эффекта ASD, FGID или ASD * FGID при анализе всех 59 ASD и 44 NT братьев и сестер.

Таблица 4. Сравнение QPCR выбранных бактериальных подгрупп у детей с РАС с FGID, детей с РАС без FGID, братьев и сестер NT с FGID и братьев и сестер NT без FGID.

Анализы qPCR проводили с использованием установленных праймеров, как описано в разделе «Методы».Приведены средние значения ΔCt (~ Log2 относительной численности целевых бактериальных подгрупп) ± стандартные отклонения. Включены данные от совпадающих и несоответствующих родственников ASD и NT братьев и сестер.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137725.t004

Анализ последовательности 16S рРНК у детей с РАС и NT братьев и сестер

Мы выполнили Illumina секвенирование гипервариабельной области V1V3 бактериального гена 16S рРНК для облегчения сравнения этих данных с предыдущими наборами данных пиросеквенирования 16S рРНК 454 гипервариабельной области V1V3 [16,23].Всего было сгенерировано 11 050 770 высококачественных последовательностей (медиана 1,1E + 05 последовательностей / образец, IQR от 8,0e + 04 до 1,2E + 05). Все библиотеки имели показатель охвата по Гуду ≥ 99,9% в точке разрежения 15 000 последовательностей, что указывает на то, что для каждого образца был достигнут глубокий охват микробиома кишечника. Чтобы подтвердить результаты, полученные с помощью секвенирования V1V3, мы также выполнили секвенирование Illumina гипервариабельной области V1V2. Всего было сгенерировано 14 783 994 высококачественных последовательности (медиана 1.4E + 05 последовательности / образец, IQR от 1.3e + 05 до 1.6E + 05; минимальное покрытие товара = 99,9%). Не наблюдалось значительного влияния ASD, FGID или ASD * FGID на сложность или богатство OTU, два показателя α-разнообразия, разнообразие Шеннона и Chao 1 (средние значения см. В таблице , ). Не было отмечено значительных различий (p <0,05) в β-разнообразии между сообществами бактерий-сиблингов ASD и NT, проанализированных на уровне филы, семейства или рода и с использованием индексов Брея-Кертиса, Жаккара или Мориситы-Хорна в качестве измерений несходства.

Таблица 5. Показатели Shannon H и SChao1 у детей с РАС с FGID, детей с РАС без FGID, братьев и сестер NT с FGID и братьев и сестер NT без FGID.

Средние значения для каждой из этих оценок ± стандартное отклонение показаны ниже для наборов данных V1V2 и V1V3. Включены данные о совпадающих и несоответствующих семьях детей с РАС и братьев и сестер с NT.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137725.t005

Относительная численность основных четырех типов (Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria) у детей с РАС с FGID, детей с ASD без FGID, NT братья и сестры с FGID и братья и сестры NT без групп FGID для наборов данных V1V2 и V1V3 показаны на Рис. 1 (см. S2 Таблицу ).Также были обнаружены типы с меньшей численностью, включая RF3, Tenericutes, Cyanobacteria, Verrucomicrobia, Lentisphaerae и Fusobacterium (см. S3, таблица ). Пермутационный тест Хотеллинга не выявил значительных различий в общем микробном составе при объединении на уровне филы между детьми с РАС и братьями и сестрами с NT. За исключением типа Verrucomicrobia, относительная численность типов была сходной между наборами данных V1V2 и V1V3. Исследовательский анализ отдельных типов не выявил значимого эффекта (FDR <0.1) взаимодействий первого порядка ASD, FGID или ASD * FGID для любого из отдельных типов, включая Bacteroidetes, с использованием отрицательной биномиальной модели. На уровне рода было обнаружено 359 операционных таксономических единиц (OTU) для набора данных V1V2 и 189 OTU для наборов данных V1-V3, соответственно. Не было обнаружено значимых ассоциаций между относительной численностью родов Sutterella или Prevotella и взаимодействиями первого порядка ASD, FGID или ASD * FGID (см. Таблица 6 ) ни в наборах данных V1V2, ни в V1V3.Исследовательский анализ отдельных родов выявил значительный эффект (FDR <0,1) взаимодействий первого порядка ASD и ASD * FGID на род Cyanobacteria / Chloroplast для наборов данных V1V2 и / или V1V3 с использованием отрицательной биномиальной модели с нулевым завышением (см. Таблица 6). Средняя относительная численность этого рода была увеличена в группе ASD-с FGID по сравнению с таковыми из трех других категорий (ASD без FGID, NT братьев и сестер с FGID и NT братьев и сестер без FGID; средние относительные количества см. В S4 таблице ) .Анализ последовательности 16S РНК микробиоты кишечника человека ранее обнаружил последовательности, объединенные в тип Cyanobacteria. Эти последовательности могут представлять геномные последовательности 16S рРНК хлоропласта, присутствующие в диетической растительной пище или новых некультивируемых видах бактерий. Метагеномные исследования выявили новые нефотосинтетические таксоны, названные «Melainabacteria», присутствующие во флоре кишечника человека, которые представляют собой либо родственный тип, либо класс внутри типа Cyanobacteria [65,66]. Однако база данных Silva, использованная в текущем исследовании, объединила последовательности Melainabacteria в таксон, отличный от таксона Chloroplast .Изучение ежедневных дневников питания всех испытуемых показало, что двух детей с РАС с FGID (функциональный запор), которые имели высокую относительную численность этого рода и, следовательно, доминировали в сигнале, связанном с ASD с категорией FGID, кормили семенами чиа, добавленными в коктейли. Никто из других субъектов не ел семена чиа, за исключением одного ребенка с РАС, который проглотил порцию смешанного зернового хлеба, в который входили зерна чиа. Следует отметить, что семена чиа рекламируются как лекарство от аутизма в Интернете [67,68].

Рис. 1. Сравнение типов детей с РАС с FGID, детей с РАС без FGID, братьев и сестер NT с FGID и братьев и сестер NT без FGID, с использованием наборов данных Illumina V1-V2 и V1-V3.

Средняя относительная численность каждого типа (относительная численность ≥ 0,02) показана для ASD с FGID, ASD без FGID, NT с FGID и NT без FGID для каждого из двух наборов данных секвенирования (см. Таблицы S1 и S2. для средних значений ± стандартное отклонение).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137725.g001

Таблица 6. Таксоны с низкой численностью, объединенные на уровне родов, которые в значительной степени связаны с взаимодействиями первого порядка ASD, FGID или ASD * FGID.

FDR для каждого таксона с низкой численностью перечислены ниже для наборов данных V1V2 и V1V3 с порогом значимости <0,1. N.D. не обнаруживается на основании критериев фильтрации. FDR также перечислены для двух родов, Sutterella и Provetella, которые, как сообщалось ранее, были увеличены и уменьшены, соответственно, у детей с РАС по сравнению с неродственными детьми контрольной группы [10,11].

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137725.t006

Только для набора данных V1V2 значимые ассоциации наблюдались для 1) взаимодействий первого порядка ASD и ASD * FGID с Firmicutes / Asteroleplasma , 2) ASD , FGID и ASD * FGID взаимодействия первого порядка с Proteobacteria / Thalassospira и 3) FGID и ASD * FGID взаимодействия первого порядка с Proteobacteria / Burkholderia (см. Таблица 5 и S4 Таблица ).Род Firmicutes / Asteroleplasma , по-видимому, представляет группу некультивируемых безоболочечных микобактерий подобных организмов в пределах класса Erysipelotrichia [69]. Род Proteobacteria / Thalassospira , по-видимому, представляет альфа-протеобактерии, присутствующие в бактериопланктоне и ряде некультивируемых организмов [70]. Последовательности, объединенные в этот таксон Proteobacteria / Burkholderia , представляют неклассифицированные последовательности в пределах порядка Burkholderia , которые не попадают в семейство Comamonadaceae (см. Ниже).

Только для набора данных V1V3 значимые ассоциации наблюдались для 1) взаимодействий первого порядка ASD и ASD * FGID с Proteobacteria / Comamonadaceae , 2) взаимодействий первого порядка ASD, FGID и ASD * FGID с Fusobacteria . Fusobacteriales , 3) взаимодействия ASD * FGID первого порядка с Bacteroidetes / Prevotellaceae и 4) взаимодействия ASD и ASD * FGID с Actinobacteria / Mobiluncus . Эти ассоциации, однако, не достигли значимости в наборе данных V1V2. Proteobacteria / Comamonadaceae – большое и разнообразное семейство бактерий из отряда Burkholderiales (см. Выше). Последовательности, объединенные в этот таксон Fusobacteria / Fusobacteriales , представляют неклассифицированные последовательности в семействе Fusobacteriales , которые не объединены в род Fusobacterium . Последовательности, объединенные в таксон Bacteroidetes / Prevotellaceae , представляют неклассифицированные последовательности в семействе Prevotellaceae , которые не объединяются в род Prevotella .Род Actinobacteria / Mobiluncus ранее был связан с бактериальным вагинозом [71].

Сравнение измерений MiSeq V1V2, V1V3 и количественной ПЦР для выбранных категорий бактерий

Сравнение относительной численности типа Bacteroidetes и родов Sutterella и Prevotella показывает высокую корреляцию между MiSeq V1V2 и V1V3 (ρ ≈ 0,9) и небольшие пропорциональные смещения (таблица S5 и S1, рис.) . Различные обратные праймеры, 338R и 534R, используемые для амплификации, соответственно, областей V1V2 и V1V3, могут иметь небольшие различия в специфичности. Хотя в целом измерения между платформами MiSeq и qPCR были положительно коррелированы, мы наблюдали большие систематические ошибки, особенно для двух родов с относительно низкой численностью, Sutterella и Provetella . Это может отражать, по крайней мере частично, то, что глубина секвенирования была недостаточной для точного измерения категорий бактерий с относительно низкой численностью.

Обсуждение

Это исследование 59 детей с РАС и 44 братьев и сестер в Simons Simplex Community через регистр Interactive Autism Network (SSC @ IAN) было мотивировано предыдущими сообщениями, связывающими симптомы РАС, желудочно-кишечного тракта с изменениями в микробиоте кишечника (см. Рис. 2) , а некоторые просто связывают ДМПП с кишечной микробиотой (см. Рис. 3 ) . В этих предыдущих исследованиях кишечных микробных сообществ у детей с РАС использовались как неродственные контрольные дети, так и NT братьев и сестер детей с РАС.Одно исследование также включало связанные расстройства, такие как синдром Аспергера или общее расстройство развития, не указанное иным образом (PDD-NOS), в качестве контрольной популяции без ASD. В нашем текущем исследовании сравнивали микробный состав и разнообразие у детей с РАС, имеющих только NT братьев и сестер. Из 44 братьев и сестер с NT 37 были сопоставлены по семье с детьми с РАС в исследовании, а остальные семь детей с NT были братьями и сестрами детей с РАС, которые не участвовали в текущем исследовании, в некоторых случаях потому, что ребенок с РАС был старше 14 лет. .В этом исследовании не воспроизводились ранее сообщенные различия в относительной численности категорий бактерий, включая тип Bacteroidetes [12–14], род Sutterella [7,8,10] и род Prevotella [11], между детьми с РАС и неродственными контрольными детьми. Это может отражать меньшее количество субъектов, включенных в предыдущие исследования, что может привести к ошибкам 1-го типа. В одном исследовании использовались образцы слизистой оболочки кишечника [10], а не фекалий. Следует отметить, что предыдущие исследования [6–8,12,14], за исключением одного исследования [13], не смогли выявить различий в микробном составе между ASD и NT братьями и сестрами [11].Наше исследование также не обнаружило различий ни в α, ни в β разнообразии между ASD и NT братьями и сестрами.

Рис. 2. Резюме исследований, сравнивающих микробиоту кишечника у детей с РАС и NT с и без желудочно-кишечных симптомов.

РАС с желудочно-кишечным трактом, дети с РАС с симптомами желудочно-кишечного тракта, РАС без желудочно-кишечного тракта, дети с РАС без симптомов со стороны желудочно-кишечного тракта, дети с NT и GI, братья и сестры с NT с симптомами желудочно-кишечного тракта; NT sib без GI, NT братья и сестры без GI симптомов, NT Un Con w GI, неродственный контроль с GI симптомами; Un Con w / o GI, несвязанные контроли без симптомов GI; PDD-NoS, повсеместное нарушение развития, не указанное иначе.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137725.g002

В этом исследовании секвенирование 16S рРНК с использованием MiSeq было проведено с большей глубиной, чем в предыдущих исследованиях с использованием пиросеквенирования. Обе платформы обнаружили повышенную относительную численность рода Chloroplast с низкой численностью в ASD по сравнению с NT-братьями и сестрами. Изучение дневных журналов питания детей с РАС с большим количеством последовательностей хлоропластов показало, что именно этих детей кормили коктейлями, содержащими семена чиа.Мы предполагаем, что наблюдаемое увеличение относительного количества последовательностей хлоропластов могло отражать употребление в пищу семян чиа этими детьми.

Альтернативное объяснение того, почему исследование, сравнивающее детей с РАС с NT братьями и сестрами, не воспроизвело различия, о которых сообщалось между детьми с РАС из неродственной группы контроля, состоит в том, что NT братья и сестры детей с РАС изменили микробиомы по сравнению с микробиомами неродственных детей [24]. Исследования, отслеживающие братьев и сестер детей с РАС, выявили уязвимости в некоторых нейрокогнитивных областях в отсутствие диагноза РАС [72], предполагая, что некоторые из братьев и сестер с NT могут проявлять более широкий субклинический фенотип РАС.

Обзор предыдущих исследований показывает, что симптомы ЖКТ чаще встречаются у детей с РАС, чем у детей с НТ, но эти исследования страдают от методологических различий в оценке симптомов ЖКТ [28–31]. Наша оценка желудочно-кишечных симптомов отличается от предыдущих исследований тем, что мы использовали международный стандарт для оценки FGID в общей педиатрической популяции. Из-за потенциального совпадения диагнозов ROME III FGID мы разделили детей с РАС и братьев и сестер с NT на две категории: 1) те, у кого есть хотя бы один FGID и 2) те, у кого нет FGID.В текущем исследовании высокая распространенность детей, у которых был диагностирован хотя бы один FGID, наблюдалась как у детей с РАС (~ 40%), так и у братьев и сестер NT (~ 30%). Предыдущие эпидемиологические исследования с использованием процесса ROME III для изучения распространенности ребенка, имеющего хотя бы один FGID в общих педиатрических клиниках, показали распространенность 2% и 16% соответственно [73,74], что позволяет предположить, что у братьев и сестер NT также может быть более высокая частота. распространенность FGID, чем в общей педиатрической популяции.

Настоящее исследование выявило повышенную распространенность функционального запора FGID у детей с РАС по сравнению с братьями и сестрами с NT (см. Таблицы 1 и 2 ).Ранее считалось, что запор является серьезной сопутствующей патологией у детей с РАС [28–31]. Дальнейшие исследования на более широкой выборке братьев и сестер с РАС и NT (желательно из семейной пары), а также неродственных NT детей необходимо будет провести, чтобы определить: 1) являются ли FGID, особенно функциональные запоры, более распространенными у детей с ASD, чем их NT братьев и сестер, и 2 ) являются ли FGID, особенно функциональные запоры, более распространенными у NT братьев и сестер детей с РАС, чем у неродственных контрольных детей.

Также было высказано предположение, что дети с РАС с симптомами желудочно-кишечного тракта могут отличаться от детей с РАС без симптомов желудочно-кишечного тракта. Адамс и др. [15] сообщили, что симптомы со стороны желудочно-кишечного тракта, которые оценивались по модифицированной шкале 6-GSI, коррелировали с тяжестью РАС, которая оценивалась с помощью контрольного списка для оценки лечения аутизма, заполненного родителями (ATEC) [15]. Однако в нашем исследовании средние показатели тяжести по шкале ADOS-CSS, которые основаны на оценках врача, а не родителей, существенно не различались между детьми с РАС с хотя бы одним FGID и детьми без какого-либо FGID.

Чтобы оценить общий эмоциональный и поведенческий статус братьев и сестер с РАС и NT, мы проанализировали нормализованные Т-баллы, заполненные родителями по шкале CBCL6 / 18. Результаты этого исследования продемонстрировали, что дети с РАС с или без FGID показали значительно более высокие баллы, чем братья и сестры NT без FGID, что согласуется с предыдущими исследованиями, в которых сообщалось о более высоких баллах у детей с РАС по сравнению с детьми контрольной группы [34–37]. Однако это исследование продемонстрировало, что NT-братья и сестры с хотя бы одним FGID имели нормализованные T-баллы CBCL6 / 18, которые приближались к таковым у детей с РАС с или без хотя бы одного FGID, а также были значительно выше, чем NT-братья и сестры без каких-либо FGID.

Хотя это одно из самых крупных исследований, сравнивающих РАС, FGID и микробиоту кишечника у детей с РАС и братьев и сестер с NT, размер нашей выборки все еще невелик, учитывая количество включенных переменных. Для подтверждения результатов, представленных в этом исследовании, необходимо будет провести набор дополнительных детей с РАС и их братьев и сестер с NT (желательно из семьи), а также неродственных детей из контрольной группы, которые используют те же инструменты фенотипирования. Кроме того, может потребоваться возможное ограничение потребления с пищей добавок растительного происхождения, таких как семена чиа, чтобы определить, имеет ли сигнал цианобактерий / хлоропластов биологическое значение с точки зрения патофизиологии РАС.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Сравнение платформ измерений для MiSeq V1V2, MiSeq V1V3 и qPCR.

Относительная численность, преобразованная в квадратный корень, нанесена на график для каждой пары платформ с подобранной линией в предлагаемой модели SEM. Для двух идеально согласованных платформ подобранная линия равна y = x.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137725.s001

(TIF)

S2 Стол. Относительное количество основных типов для детей с РАС с FGID, детей с ASD без FGID, NT братьев и сестер с FGID и NT братьев и сестер без FGID.

Средняя относительная численность (подсчет последовательностей для типа / общего подсчета последовательностей) ± стандартное отклонение для наборов данных V1V2 и V1V3 приведены ниже. Включены данные о совпадающих и несоответствующих семьях детей с РАС и братьев и сестер с NT.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137725.s003

(DOCX)

S3 Таблица. Относительная численность типов с низкой численностью для ASD с FGID, ASD без FGID, NT с FGID и NT без FGID, на основе наборов данных V1V2 и V1V3.

Средняя относительная численность (количество последовательностей для типа / общее количество последовательностей) ± стандартное отклонение указаны для каждого типа.Включены данные о детях с РАС и братьях и сестрах NR, совпадающих с семьей.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137725.s004

(DOCX)

S4 Таблица. Относительное количество выбранных таксонов у детей с РАС с FGID, ASD без FGID, NT сибсов с FGID и NT сибсов без FGID.

Средняя относительная численность (количество последовательностей для родов / общее количество последовательностей) ± стандартные отклонения перечислены для наборов данных V1V2 и V1V3. N.D. не обнаруживается на основании критериев фильтрации.Таксоны, которые продемонстрировали значительные эффекты взаимодействий первого порядка ASD, FGID и / или ASD * FGID, обозначены жирным шрифтом . Включены данные от семейных и несовместимых детей с РАС.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137725.s005

(DOCX)

S5 Стол. Сравнение платформ измерений для MiSeq V1V2, MiSeq V1V3 и qPCR.

95% доверительный интервал оценочных коэффициентов в предложенной модели SEM перечислены попарно. Для двух идеально согласованных платформ наклон равен 1, а точка пересечения – 0.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137725.s006

(DOCX)

Благодарности

Мы благодарны всем семьям на сайтах SFARI Simplex Collection (SSC), сотрудникам SFARI и Interactive Autism Network (Институт Кеннеди Крейгера) и Мэриэнн Пэрриш Р.Н. за помощь в процессе набора на учебу. Мы благодарим Эрума Ахмеда за помощь в извлечении образцов фекальной ДНК и проведение анализов кПЦР и Кристин Коллинз за помощь в извлечении фекальной ДНК, проведении анализов кПЦР и ввод данных для дневников питания.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: JS LJZ GG LL-K KDG DF EL. Проведены эксперименты: JS LJZ LMR CER DI DF. Проанализированы данные: JS LJZ XT YZ WZ LL-K GG CER DF EL. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: JS LJZ LR XT YZ WZ GG LL-K CER DF EL. Написал документ: EL JS LJZ LMR LL-K LMR XT YZ WZ GG KDG CR DI DF.

Ссылки

1. 1. Wingate M, Kirby RS, Pettygrove S, Cunniff C, Schulz E, Ghosh T. и др. (2014) Распространенность расстройства аутистического спектра среди детей в возрасте 8 лет – Сеть мониторинга аутизма и пороков развития, 11 сайтов, США, 2010 г.MMWR Surveill Summ. 63: 1–21.
2. 2. Ким Ю.С., Левенталь Б.Л. (2015) Генетическая эпидемиология и понимание интерактивных генетических и экологических эффектов при расстройствах аутистического спектра. Биол Психиатрия. 77: 66–74 PMID: 25483344
3. 3. Colvert E, Tick B, McEwen F, Stewart C, Curran SR, Woodhouse E, et al. (2015) Наследственность расстройства аутистического спектра в выборке близнецов из популяции Великобритании. JAMA Psychiatry. 72: 415–23. pmid: 25738232
4. 4. Франк Д. Н., Чжу В., Сартор Р. Б., Ли Э.(2011) Изучение биологического и клинического значения дисбиоза человека. Trends Microbiol. 19: 427–34. pmid: 21775143
5. 5. Krajmalnik-Brown R, Lozupone C, Kang DW, Adams JB. (2015) Кишечные бактерии у детей с расстройствами аутистического спектра: проблемы и перспективы изучения того, как сложное сообщество влияет на сложное заболевание. Microb Ecol Health Dis. 26: 26914 pmid: 25769266
6. 6. Паррачо Х.М., Бингем М.О., Гибсон Г.Р., Маккартни А.Л. (2005) Различия между кишечной микробиотой детей с расстройствами аутистического спектра и здоровых детей.J Med Microbiol. 2005; 54: 987–91. pmid: 16157555
7. 7. Ван Л., Кристоферсен К. Т., Сорич М. Дж., Гербер Дж. П., Энгли М. Т., Конлон Массачусетс. (2011) Низкая относительная численность муколитических бактерий Akkermansia muciniphila и Bifidobacterium spp. в кале детей с аутизмом. Appl Environ Microbiol 77: 6718–21. pmid: 21784919
8. 8. Ван Л., Кристоферсен К. Т., Сорич М. Дж., Гербер Дж. П., Энгли М. Т., Конлон Массачусетс. (2013) Увеличение численности Sutterella spp. и Ruminococcus Torques в кале детей с расстройствами аутистического спектра.Молочный аутизм. 2013; 4: 42. pmid: 24188502
9. 9. Гондалия С.В., Паломбо Е.А., Ноулз С.Р., Кокс С.Б., Мейер Д., Остин Д.В. (2012) Молекулярная характеристика микробиоты желудочно-кишечного тракта у детей с аутизмом (с желудочно-кишечной дисфункцией и без) и их нейротипичных братьев и сестер. Аутизм Res 5: 419–27. pmid: 22997101
10. 10. Уильямс Б.Л., Хорниг М., Парех Т., Липкин В.И. (2012) Применение новых методов на основе ПЦР для обнаружения, количественного определения и филогенетической характеристики видов Sutterella в образцах биопсии кишечника от детей с аутизмом и желудочно-кишечными расстройствами.MBio 3: pii: e00261–11. pmid: 22233678
11. 11. Канг Д.В., Пак Дж. Г., Ильхан З. Э., Уоллстром Дж., Лабер Дж., Адамс Дж. Б. и др. (2013) Снижение встречаемости Prevotella и других ферментеров в кишечной микробиоте аутичных детей. PLoS One 8: e68322. pmid: 23844187
12. 12. Томова А., Хусарова В., Лакатосова С., Бакос Дж., Влкова Б., Бабинская К. и др. (2015) Микробиота желудочно-кишечного тракта у детей с аутизмом в Словакии. Physiol Behav 138: 179–87. pmid: 25446201
13. 13.Де Анжелис М., Пикколо М., Ваннини Л., Сирагуса С., Де Джакомо А., Серраццанетти Д. И. и др. (2013). Микробиота кала и метаболом детей с аутизмом и общим нарушением развития, не уточненных иначе. PLoS One, 8 (10), e76993. pmid: 24130822
14. 14. Finegold SM, Dowd SE, Gontcharova V, Liu C, Henley KE, Wolcott RD, et al. (2010) Исследование фекальной микробиоты аутичных и контрольных детей методом пиросеквенирования. Анаэроб 16: 444–53. pmid: 20603222
15. 15.Адамс Дж. Б., Йохансен Л. Дж., Пауэлл Л. Д., Куиг Д., Рубин Р. А.. (2011) Желудочно-кишечная флора и состояние желудочно-кишечного тракта у детей с аутизмом – сравнение с обычными детьми и корреляция с тяжестью аутизма. BMC Gastroenterol 11:22 pmid: 21410934
16. 16. Saulnier DM, Riehle K, Mistretta TA, Diaz MA, Mandal D, Raza S и др. (2011) Сигнатуры микробиома желудочно-кишечного тракта у педиатрических пациентов с синдромом раздраженного кишечника. Гастроэнтерология. 141: 1782–91. pmid: 21741921
17. 17.Симрен М., Барбара Дж., Флинт Х.Дж., Шпигель Б.М., Спиллер Р.С., Ваннер С. и др. (2013) Кишечная микробиота при функциональных расстройствах кишечника: доклад Римского фонда. Кишечник 69: 159–76
18. 18. Шанкар В., Аганс Р., Холмс Б., Раймер М., Палий О. (2013) Отличаются ли кишечные микробные сообщества по педиатрическому СРК и состоянию здоровья? Кишечные микробы. 4: 347–52 pmid: 23674073
19. 19. Kim SE, Choi SC, Park KS, Park MI, Shin JE, Lee TH и др. (2015) Изменение фекальной флоры и эффективность краткосрочного лечения пробиотиками VSL # 3 у пациентов с функциональным запором.J Neurogastroenterol Motil. 2015; 21: 111–20. pmid: 25537674
20. 20. Рингель Ю., Махаршак Н. (2013) Микробиота кишечника и иммунная функция в патогенезе синдрома раздраженного кишечника. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305: G529–41. pmid: 23886861
21. 21. Rajilić-Stojanović M, Biagi E, Heilig HG, Kajander K, Kekkonen RA, Tims S и др. (2011) Глобальный и глубокий молекулярный анализ микробиоты в образцах фекалий пациентов с синдромом раздраженного кишечника.Гастроэнтерология. 141: 1792–801. pmid: 21820992
22. 22. Джеффри И.Б., О’Тул П.В., Оман Л., Клаессон М.Дж., Дин Дж., Куигли Е.М. и др. (2012) Подтип синдрома раздраженного кишечника, определяемый видоспецифическими изменениями в фекальной микробиоте. Кишечник. 61: 997–1006. pmid: 22180058
23. 23. Ли Э., Хамм С.М., Гулати А.С., Сартор Р.Б., Чен Х., Ву Х и др. (2012) Фенотип воспалительных заболеваний кишечника, генотип C. difficile и NOD2 связаны со сдвигами в микробном составе подвздошной кишки человека.PLoS One.7: e26284. pmid: 22719818
24. 24. Krajmalnik-Brown R, Lozupone C, Kang DW, Adams JB. (2015) Кишечные бактерии у детей с расстройствами аутистического спектра: проблемы и перспективы изучения того, как сложное сообщество влияет на сложное заболевание. Microb Ecol Health Dis 26: 26914. pmid: 25769266
25. 25. Rasquin A, Di Lorenzo C, Forbes D, Guiraldes E, Hyams JS, Staiano A и др. (2006) Функциональные желудочно-кишечные расстройства в детском возрасте: дети / подростки. Гастроэнтерология.130: 1527–37. pmid: 16678566
26. 26. Джонс МП, Дилли Дж. Б., Дроссман Д., Кроуэлл, доктор медицины. (2006) Связи между мозгом и кишечником при функциональных расстройствах желудочно-кишечного тракта: анатомические и физиологические взаимосвязи. Нейрогастроэнтерол Мотил. 18: 91–103. pmid: 16420287
27. 27. Schneider CK, Melmed RD, Barstow LE, Enriquez FJ, Ranger-Moore J, Ostrem JA: (2006) Пероральный человеческий иммуноглобулин для детей с аутизмом и желудочно-кишечной дисфункцией: проспективное открытое исследование. J Autism Dev Disord.36: 1053–64. pmid: 16845577
28. 28. МакЭлханон Б.О., Маккракен С., Карпен С., Sharp WG. (2014) Желудочно-кишечные симптомы при расстройстве аутистического спектра: метаанализ. Педиатрия. 133: 872–83. pmid: 24777214
29. 29. Hsiao EY (2014) Желудочно-кишечные проблемы при расстройстве аутистического спектра. Harv Rev Psychiatry 22: 104–11. pmid: 24614765
30. 30. Furuta GT, Williams K, Kooros K, Kaul A, Panzer R, Coury DL и др. (2012) Лечение запоров у детей и подростков с расстройствами аутистического спектра.Педиатрия. 130 Приложение 2: S98–105. pmid: 23118260
31. 31. Gorrindo P, Williams KC, Lee EB, Walker LS, McGrew SG, Levitt P. (2012) Желудочно-кишечная дисфункция при аутизме: отчет родителей, клиническая оценка и связанные факторы. Autism Res. 5: 101–8. pmid: 22511450
32. 32. Fischback GD, Lord C. (2010) The Simons Simplex Collection: ресурс для идентификации генетических факторов риска аутизма. Нейрон. 68: 192–95. pmid: 20955926
33. 33. Achenbach TM, Rescorla LA.(2001) Руководство по формам и профилям школьников ASEBA: интегрированная система мультиинформантной оценки. Берлингтон: Университет Вермонта, Исследовательский центр для детей, молодежи и семьи.
34. 34. Дуарте С.С., Бордин И.А., де Оливейра А., Берд Х. (2003) CBCL и выявление детей с аутизмом и связанными с ним состояниями в Бразилии: экспериментальные результаты. J Autism Dev Disord. 33: 703–7. pmid: 14714937
35. 35. Мазефски К.А., Андерсон Р., Коннер С.М., Миншью Н.(2011) Контрольный список поведения детей для детей школьного возраста с аутизмом: предварительные данные о моделях, предполагающих необходимость направления. J Psychopathol Behav Assess. 33: 31–37. pmid: 22661827
36. 36. Pandolfi V, Magyar CI, Dill CA. (2012) Первоначальная психометрическая оценка CBCL 6–18 в выборке молодых людей с расстройствами аутистического спектра. Res Autism Spectr Disord. 6: 96–108. pmid: 22059091
37. 37. Скокаускас Н., Галлахер Л. (2012) Аспекты психического здоровья при расстройствах аутистического спектра у детей.J Интеллект Disabil Res. 56: 248–57. pmid: 21554467
38. 38. Маэда Х., Фудзимото С., Харуки Й., Маеда Т., Кокекучи С., Петелин М. и др. (2003) Количественная ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan и SYBR Green для Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, гена tetQ и всех бактерий. FEMS Immunol Med Microbiol. 39: 81–86. pmid: 14557000
39. 39. Франк Д. Н., Сент-Аманд А. Л., Фельдман Р. А., Boedeker EC, Harpaz N, Pace NR. (2007) Молекулярно-филогенетическая характеристика дисбаланса микробного сообщества при воспалительных заболеваниях кишечника человека.Proc Natl Acad Sci U S. A. 104: 13780–85. pmid: 17699621
40. 40. Ларсен Н., Фогенсен Ф.К., ван ден Берг Ф.В.Дж., Нильсен Д.С., Андреасен А.С., Педерсен Б.К. и др. (2010) Микробиота кишечника взрослых людей с диабетом 2 типа отличается от взрослых людей, не страдающих диабетом. PLoS One 5: e9085. pmid: 20140211
41. 41. Rinttilä T, Kassinen A, Malinen E, Krogius L, Palva A. (2004) Разработка обширного набора праймеров, нацеленных на 16S рДНК, для количественной оценки патогенных и местных бактерий в образцах фекалий с помощью ПЦР в реальном времени.J. Appl. Microbiol. 97: 1166–77. pmid: 15546407
42. 42. Гулати А.С., Шанахан М.Т., Артур Дж. К., Гроссниклаус Э., фон Фюрстенберг Р. Дж., Кройк Л. и др. (2012) Мышиный фоновый штамм оказывает глубокое влияние на функцию клеток Панета и микробный состав кишечника. PLoS One. 7: e32403. pmid: 22384242
43. 43. Hara N, Alkanani AK, Ir D, Robertson CE, Wagner BD, Frank DN, et al. (2012) Профилактика вирусного диабета 1 типа с помощью антибактериальной терапии. J Immunol 189: 3805–14.pmid: 22988033
44. 44. Маркл Дж. Г., Франк Д. Н., Мортин-Тот С., Робертсон К. Э., Физел Л. М., Ролл-Кампчик У. и др. (2013) Половые различия в микробиоме кишечника управляют гормонально-зависимой регуляцией аутоиммунитета. Наука 339: 1084–88. pmid: 23328391
45. 45. Ewing B, Hillier L, Wendl MC, Green P. (1998) Вызов базы данных автоматического секвенсора с использованием phred. I. Оценка точности. Genome Res 8: 175–85. pmid: 9521921
46. 46. Edgar RC, Haas BJ, Clemente JC, Quince C, Knight R (2011) UCHIME улучшает чувствительность и скорость обнаружения химер.Биоинформатика 27: 2194–2200. pmid: 21700674
47. 47. Schloss PD, Westcott SL (2011) Оценка и улучшение методов, используемых в операционных подходах на основе таксономических единиц для анализа последовательности гена 16S рРНК. Appl Environ Microbiol 77: 3219–26. pmid: 21421784
48. 48. Pruesse E, Peplies J, Glockner FO (2012) SINA: точное высокопроизводительное выравнивание множественных последовательностей генов рибосомной РНК. Биоинформатика 28: 1823–29. pmid: 22556368
49. 49. Quast C, Pruesse E, Yilmaz P, Gerken J, Schweer T., Yarza P, et al.(2013) Проект базы данных генов рибосомной РНК SILVA: улучшенная обработка данных и веб-инструменты. Нуклеиновые кислоты Res 41: D590–96. pmid: 23193283
50. 50. Макдональд Дж. (2009). Справочник по биологической статистике (Том 2, стр. 64–68). Балтимор, Мэриленд: Издательство Sparky House.
51. 51. Робертсон С.Д., Харрис Дж. К., Вагнер Б. Д., Грейнджер Д., Браун К., Татем Б. и др. (2013) Explicet: программное обеспечение с графическим пользовательским интерфейсом для управления, анализа и визуализации данных микробиома на основе метаданных.Биоинформатика 29: 3100–01. pmid: 24021386
52. 52. Франк Д. Н., Бейлз Э. С., Монкс Дж., Джекман М. Дж., Маклин П. С., Ир Д. и др. (2015) Перилипин-2 модулирует всасывание липидов и ответы микробиома в кишечнике мышей. PLoS One 10: e0131944. pmid: 26147095
53. 53. Оксанен Дж., Киндт Р., Лежандр П., О’Хара Б., Симпсон Г.Л., Солимос П., О’Хара Р.Б. и др. (2008) Веган: Пакет Экологии Сообщества. Пакет R версии 1.15–1. Доступно: http://cran.r-project.org/, http: // vegan.r-forge.r-project.org.
54. 54. Андерсон MJ (2001) Новый метод непараметрического многомерного дисперсионного анализа. Австралийская экология 26: 32–46.
55. 55. Андерсон MJ, Crist TO, Chase JM, Vellend M, Inouye BD, Freestone AL, et al. (2011) Навигация по множеству значений β-разнообразия: дорожная карта для практикующего эколога. Ecol Lett. 14: 19–28. pmid: 21070562
56. 56. Ким Р.Дж., Бисвас К., Хоггард М., Тейлор М.В., Дуглас Р.Г. (2015) Парный анализ микробиоты поверхностной слизи и образцов цельной ткани у пациентов с хроническим риносинуситом.Int Forum Allergy Rhinol. pmid: 26215930
57. 57. Курран Дж. М. (2013). Хотеллинг: критерий Т-квадрата Хотеллинга и варианты. Пакет R версии 1.0–2. Доступно: http://cran.r-project.org/package=hotelling.
58. 58. Макмерди П.Дж., Холмс С. (2014) Не тратьте впустую, не хотите: почему разрежение данных микробиома недопустимо. PLoS Comput Biol. 10: e1003531. pmid: 24699258
59. 59. Benjamini Y, Hochberg Y. (1995) Контроль ложного обнаружения: практичный и мощный подход к множественному тестированию.J R Statist Soc B 57: 289–300.
60. 60. Скауг Х, Фурнье Д., Болкер Б., Магнуссон А., Нильсен А. (2015). Обобщенные линейные смешанные модели с использованием построителя моделей AD. Пакет R версии 0.8.1.
61. 61. Бейтс Д., Махлер М., Болкер Б., Уокер С. (2014). lme4: линейные модели смешанных эффектов с использованием Eigen и S4. Пакет R версии 1.1–7, Доступно: http://CRAN.R-project.org/package=lme4.
62. 62. Sokal RR, Rohlf FJ. (1994) Биометрия: принципы и практика статистики в биологических исследованиях.Фриман, Нью-Йорк.
63. 63. Wu X, Berkow K, Frank DN, Li E, Gulati AS, Zhu W. (2013) Сравнительный анализ платформ измерения микробиома с использованием моделирования структурных уравнений скрытых переменных. BMC Bioinformatics. 14:79. pmid: 23497007
64. 64. Rosseel Y. (2012) пакет lavaanAn R для моделирования структурных уравнений. JSS 48: 1–36.
65. 65. Ди Риенци С.К., Шарон И., Райтон К.С., Корен О., Хуг Л.А., Томас Британская Колумбия и др. (2013) В кишечнике человека и грунтовых водах обитают нефотосинтезирующие бактерии, принадлежащие к новому типу-кандидату, родственнику цианобактерий.Элиф. 2: e01102. pmid: 24137540
66. 66. Soo RM, Skennerton CT, Sekiguchi Y, Imelfort M, Paech SJ, Dennis PG, et al. (2014) Расширенное геномное представление типа цианобактерий. Genome Biol Evol. 6: 1031–45. pmid: 24709563
67. 67. Доступно: http://freedom-articles.toolsforfreedom.com/autism-cure-omega-3-chia-hemp/.
68. 68. Доступно: http://www.newautism.com/ch-ch-ch-chia-how-chia-seeds-may-help-with-autism/2021/.
69. 69.Дэвис Дж. Дж., Ся Ф, Овербек Р. А., Олсен Дж. Дж. (2013) Геномы класса Erysipelotrichia проясняют твердое происхождение класса Mollicutes. Int J Syst Evol Microbiol. 63: 2727–41. pmid: 23606477
70. 70. Lai Q, Liu Y, Yuan J, Du J, Wang L, Sun F, Shao Z. (2014) Анализ мультилокусной последовательности для оценки филогенетического разнообразия и биогеографии бактерий Thalassospira из различных морских сред. PLoS One. 9: e106353 pmid: 25198177
71. 71. Ламонт Р.Ф., Собель Д.Д., Акинс Р.А., Хассан С.С., Чайворапонгса Т., Кусанович Дж.П. и др.(2011) Микробиом влагалища: новая информация о флоре половых путей с использованием молекулярных методов. BJOG. 118: 533–49. pmid: 21251190
72. 72. Wade M, Prime H, Madigan S. (2015) Использование моделей братьев и сестер для понимания нарушений нервного развития: от генов и окружающей среды до программ профилактики. Biomed Res Int. 2015: 672784. pmid: 26258141
73. 73. Миле Э., Симеоне Д., Марино А., Греко Л., Ауриккио Р., Новек С. Дж. И др. (2004) Функциональные желудочно-кишечные расстройства у детей: проспективное исследование в Италии.Педиатрия 114: 73–8. pmid: 15231910
74. 74. Karabulut GS, Beşer OF, Erginöz E, Kutlu T, Cokuğraş FÇ, Erkan T. (2013) Заболеваемость синдромом раздраженного кишечника у детей с использованием критериев Рима III и эффект лечения тримебутином. J Neurogastroenterol Motil.