Свойства протеин: Что такое протеин. Свойства и характеристики

0

Содержание

что это такое, польза и вред, как принимать. Обзор лучшего сывороточного протеина 2017

Путь построения красивого тела не прост и включает в себя далеко не одни тренировки. Для достижения наилучшего результата весь ваш образ жизни должен соответствовать желаемой цели. Прежде всего, это касается питания. Советы купить сывороточный протеин посыпятся на вас со всех сторон, как только вы решите употреблять спортивные добавки. Но, как и любой другой препарат, нельзя принимать его, не разобравшись.

Что же такое сывороточный протеин?

Подобно другим добавкам, это популярное средство имеет натуральное происхождение, а именно – животное. Как понятно из названия, получают порошок из сыворотки. Она в свою очередь представляет из себя побочный продукт при производстве сыра. Какое-то время назад производители не знали её ценности, но сейчас вопрос хорошо изучен. В водянистой части молока, которой и является сыворотка, содержатся легко усвояемые аминокислоты, лактоза, полный набор витаминов группы B, кальций и другие полезные вещества. По сути она вбирает в себя всё лучшее, что есть в молочных продуктах. По составу белок приближен к содержащемуся в женском молоке. Сложно представить себе что-то более полезное и питательное.

Почему сывороточный протеин так популярен?

Добавка эффективна для набора мышечной массы, поскольку обеспечивает организм необходимыми для построения мышц аминокислотами, в том числе незаменимыми. Соблюсти норму белка без использования спортивного питания

Кроме того, сывороточный протеин:

  • Повышает выделение гормонов, благотворно влияющих на рост мышечной ткани.
  • За счет высокого содержания лейцина снижает уровень сахара в крови и помогает скорому восстановлению кожи и костей.
  • Обладает наибольшей скоростью усвоения, поскольку данная разновидность белка быстрее перерабатывается клетками.
  • Повышает метаболизм, тем самым способствуя похудению. Однако, стоит отметить, что, в отличие от казеина, данный белок утоляет чувство голода лишь ненадолго.
  • Улучшает самочувствие, повышает иммунитет, помогает в борьбе с различными заболеваниями.

Таким образом, добавку можно применять и для похудения, при этом вы снизите процент жира и сохраните мышечную массу, но необходимо соблюдать режим дефицита калорий. Сам по себе сывороточный протеин имеет специфичный вкус, поэтому производители обычно перебивают его различными ароматизаторами. Самыми популярными являются клубника, шоколад и ваниль.

Важно понимать, что все хвалебные речи относятся прежде всего к чистому белку, который довольно сложно выделить. В реальности же смеси могут обладать пользой в разной степени и другими свойствами. Всё зависит от конкретной добавки.

Какой сывороточный протеин выбрать

Очевидно, что указанный на банке вид добавки еще не гарантирует выше описанного эффекта. Выбирая, нужно обратить внимание не только на производителя, но и на степень обработки протеина. В зависимости от этого фактора различают:

  • Концентрат. На сам белок приходится до 80% состава. Помимо него содержит лактозу, жиры и широкий спектр полезных элементов. Хорошо усваивается, не подходит для сушки.
  • Изолят. Примерно на 90% состоит из чистого протеина. Содержание жиров, лактозы и витаминов ниже.
  • Гидролизат Отличается максимальной степенью очищения и скоростью всасывания. Существенно поднимает уровень инсулина, жир и лактоза полностью удалены.

Некоторые добавки представляют из себя смесь сывороточного протеина разной степени обработки. Несмотря на не самый высокий процент содержания чистого белка, оптимальным вариантом являются концентраты. Они характеризуются большим количеством питательных веществ и относительно низкой ценой.

Лучший сывороточный протеин 2017

Для вашего удобства мы приводим ряд самых популярных и эффективных добавок. Все они отлично подходят для набора массы, в том числе профессиональными спортсменами. Если вы видите на банке протеина WHEY, значит перед вами сывороточный. При этом WPC – концентрат, WPI – изолят, WPH – гидролизат.

  • WEIDER GOLD WHEY PROTEIN

    На каждые 100 г приходится 24г белка и 23г аминокислот. Содержание сахара и жира низкое. Представлено широкое разнообразие приятных вкусов. Хорошо растворяется.

  • SAN 100% PURE TITANIUM WHEY

    Отличный вкус и премиум-качество сделали эту добавку одной из самых популярных в мире. Гарантирует эффективный набор сухой массы. Содержит дополнительные элементы для предотвращения катаболизма и активного формирования мышц.

  • DYMATIZE ELITE WHEY PROTEIN

    Хорошая смесь за умеренную цену. Предоставляет необходимую для роста и сохранения мышечной ткани концентрацию белка.

  • ULTIMATE NUTRITION PROSTAR WHEY

    Подойдет как для усердно тренирующихся атлетов, так и обычных людей, тренирующихся 1-2 раза в неделю. Лучше всего принимать после тренировки, её продолжительность значения не имеет. Позволяет не только восстановить и обеспечить рост мышц, но и укрепить иммунную систему.

  • OPTIMUM NUTRITION 100% WHEY GOLD STANDARD

    Представляет собой смесь изолята, концентрата, а также сывороточных пептидов. Содержание жиров и углеводов сведено к минимуму. Очень популярен, благодаря высокой эффективности и большому выбору вкусов.

С выбором вам также могут помочь консультанты специализированного магазина. Но и это еще не всё, теперь нужно разобраться, как добавку следует принимать.

Как правильно использовать

Сывороточный протеин обычно разводят в коктейли с водой, молоком или соком. В силу быстрого усвоения его чаще употребляют после тренировки, в течение получаса. Это позволит притупить возникшее чувство голода и оперативно восстановить питание мышц. Это наилучшее время для употребления сывороточного протеина. Кроме того, имеет смысл принимать добавку перед тренировкой – за два часа. В процессе похудения уместно заменить один из приемов пищи протеиновым коктейлем. Также полезно употреблять смесь между приемами пищи. А чтобы приостановить процесс разрушения мышц во время сна, порция протеина должна быть первым, что вы употребляете утром. Примерно через 40 минут за ней должен последовать сбалансированный завтрак. Утреннего приема достаточно, если вы не тренируетесь.

В целом сывороточный протеин не несет вреда и подходит всем, за исключением людей с непереносимостью лактозы. В силу негативного влияния большой концентрации белка на почки, людям, имеющим заболевания этих органов также стоит быть осторожными. При неправильном применении возможно возникновение пищеварительного расстройства. Неприятные ощущения могут быть вызваны вкусовыми добавками, это еще один повод внимательно изучить состав смеси.

Купить сывороточный протеин можно в любом магазине спортивного питания. Грамотно составив диету и план тренировок вы сможете добиться поразительных результатов. Нужно признать, что использование добавок дает уникальные возможности для совершенствования и поддержания физической формы.

Протеин. Свойства, виды, применение.

Протеин

Протеин в переводе с англ. "protein" - это белок. Основополагающий элемент при строительстве тканей в организме, в том числе мышечной. Протеин - это совокупность заменимых и незаменимых аминокислот, соединенных между собой. В спорте под протеином подразумевает - спортивную добавку, состоящую из высокой концентрации белка.
Это полностью натуральный продукт, полученный из белков растительного и животного происхождения!

Виды протеина

В зависимости от происхождения протеин делят на:

1.Сывороточный протеин.
  • концентрат
  • изолят
  • гидролизат
2. Казеин.
  • казеинат кальция
  • мицеллерный казеин
3. Растительный.
  • Соевый
  • конопляный
  • бобовый
  • гороховый
4. Мясной протеин.
5. Рыбный протеин.
6. Яичный протеин.

Сывороточный протеин (whey protein)

Самый популярный на сегодняшний день продукт спортивного питания — это сывороточный протеин. Он изготавливается из обычной молочной сыворотки, путем удаления жиров и других небелковых элементов в процессе фильтрации. Сывороточный протеин является быстроусвояемым, поэтому идеален для употребления до и после тренировки. Он активизирует обмен веществ, замедляет усвоение жиров и насыщает организм нужными аминокислотами для строительства мышц.
В зависимости от концентрации белка и степени очистки сывороточный протеин бывает следующих видов:

  • Концентрат сывороточного протеина. Содержит до 80% белка, при этом сохраняет в своем составе небольшое количество жиров и лактозы. Усваивается за 1,5-2 часа.

  • Сывороточный изолят. Содержит 80-95% белка – такой уровень достигается за счет более глубокой фильтрации. Усваивается за 1-1,5 часа. Практически не содержит жиров и лактозы.

  • Сывороточный гидролизат.

    Содержит 90-99% белка и предполагает очень быстрое усвоение (за 1 час). Гидролизат имеет самую высокую биологическую ценность среди сывороточных протеинов. Чем выше концентрация белка в протеиновом порошке, тем дороже его стоимость. Наиболее популярным продуктом на рынке спортивного питания является концентрат сывороточного протеина из-за оптимальной цены и высокой эффективности.

Что нужно знать о сывороточном протеине:

Быстро усваивается, поэтому сывороточный протеин идеален для приема до и после тренировки.
Имеет высокую биологическую ценность.
Содержит практически весь набор важных аминокислот.
Хорошо растворяется, имеет приятный вкус.
Из-за высокой скорости усвоения его нецелесообразно употреблять на ночь и между приемами пищи.
Время «работы» 1-2 часа.

Казеиновый протеин (Caseine)

Казеиновый протеин — это «медленный» белок, который усваивается организмом в течение длительного времени. По этой причине он не подходит для употребления до и после тренировки. Казеин также изготавливается из молока: одна его часть идет на изготовление сывороточного протеина, а другая часть – на изготовление казеинового протеина. Из-за низкой скорости усвоения, казеин является идеальным продуктом для употребления перед сном. В течение всей ночи ваши мышцы будут подпитываться «долгоиграющим» белком.

Что нужно знать о казеине:

Медленно всасывается, обеспечивая непрерывный и продолжительный приток аминокислот к мышечным волокнам.
По этой причине казеин идеален для употребления перед сном.
Нежелателен для употребления до и после тренировки.
Казеин богат кальцием.
Относительно других протеинов плохо растворяется, имеет неидеальные вкусовые качества.
Время «работы» 4-10 часов.

Молочный протеин (Milk)

Молочный протеин заметно уступает по популярности сывороточному. Этот вид протеина на 20% состоит из сывороточного белка, а на 80% – из казеина. Благодаря тому, что большая часть молочного протеина состоит из медленных белков, его можно употреблять на ночь или между приемами пищи.

Что нужно знать о молочном протеине:

Можно употреблять между приемами пищи из-за высокого содержания казеина.
Нежелателен для употребления до и после тренировки.

Содержит лактозу, поэтому не всем подходит из-за особенностей пищеварения.
Имеет невысокую стоимость.
Время «работы» 3-4 часа.


Соевый протеин (Soy Proteine)

Соевый протеин полностью состоит из растительных белков, поэтому его аминокислотный состав не до конца полноценен. Кроме того, он не оказывает такого благоприятного воздействия на рост мышц, как, например, сывороточный протеин. Однако именно соевый протеиновый порошок отлично подходит вегетарианцам и тем, у кого непереносимость молочных продуктов. Соевый протеин обычно выбирают девушки, поскольку он положительно влияет на выработку женских гормонов.

Что нужно знать о соевом протеине:

Имеет неполноценный аминокислотный состав и самую низкую биологическую ценность среди всех вышеназванных белков.
Идеален для женского организма, поскольку соя повышает уровень женских половых гормонов в организме – эстрогенов, одновременно понижая количество тестостерона.
Уменьшает уровень холестерина в организме.
Плохо растворяется в воде, имеет неидеальные вкусовые качества.
Соя – полностью растительный продукт, поэтому подойдет вегетарианцам.
Можно употреблять после тренировки и между приемами пищи.

Время «работы» 3-5 часов

Яичный протеин (EGG)

Яичный протеин имеет самуювысокую биологическую ценность, это наиболее приближенный к идеальному белку продукт. Этот вид протеина производится из яичных белков и обладает наивысшей степенью усвояемости. Не пользуется особой популярностью как самостоятельный продукт из-за высокой стоимости. Может подойти тем, у кого непереносимость молочных продуктов.

Что нужно знать о яичном протеине:

Идеален для употребления утром, до и после тренировки.
Имеет самую высокую биологическую ценность
Содержит самый полной набор аминокислот, яичный протеин можно назвать идеальным белком.
Самый дорогой по стоимости.
Время «работы» 3-5 часов.

Многокомпонентный протеин

Многокомпонентный протеин представляет собой смесь различных видов протеина (сывороточного, молочного, яичного, соевого и т.д.), что позволяет сразу получить полный набор различных аминокислот. В отличие от сывороточного он медленнее усваивается, поэтому более универсален в применении. Многокомпонентный протеин подойдет для употребления как после тренировки, так и в течение дня. Такой вид протеина часто имеют в своем составе дополнительные аминокислоты, ВСАА, глютамин, полезные жиры и даже креатин.

Что нужно знать о многокомпонентном протеине:

Можно употреблять после тренировки или между приемами пищи.
У многокомпонентного протеина не самая высокая биологическая ценность.
Имеет невысокую стоимость.
Время «работы» 3-6 часов.

Важно заметить, что каждый вид протеина (не только сывороточный) в зависимости от степени фильтрации может быть изготовлен как концентрат, изолят и гидролизат.

Таблица, где приведены скорость усвоения белков, биологическая ценность, примущества и недостатки.

Сколько белка принимать?

Таблица средней суточной нормы белка на 1 кг веса (граммы)

Например, если вы мужчина с весом 60 кг, и ваша цель - набор мышечной массы, то вам необходимо 60 кг (вес тела)*2 гр. = 120 грамм белка минимум потреблять ежедневно, что достичь данную цель.

Когда принимать протеин?

Таблица оптимально времени приёма протеина.

Протеин: состав, польза для спортсмена

Протеин, состав которого мы рассмотрим, является популярной пищевой добавкой. Цель ее использования – обеспечить питание организма (прежде всего мышц) белком при активных занятиях спортом. 

Для чего спортсмену нужен белок?

Достаточное количество белка требуется для поддержания и наращивания мышечной массы, для роста силовых показателей, а также для укрепления и восстановления всех тканей организма: суставов, сухожилий, кожи, стенок сосудов и т.п.

При активных занятиях спортом скорость метаболизма повышается, и аминокислот из белков пищевого рациона начинает не хватать. Здесь и приходит на помощь протеин – белковые добавки, обеспечивающие выносливость, работоспособность и рост мышц. Сывороточный протеин (whey), к примеру, очень быстро восполняет нехватку в аминокислотах. Состав сывороточного протеина определяет быстроту и относительную легкость его усвоения, благодаря чему его часто принимают за полчаса-час перед тренировкой, или сразу после.

Состав протеина

Поскольку очень многих волнует вопрос о том, какой у протеина состав, и как это влияет на выбор, то рассмотрим 2 самых важных момента.

1. Состав протеиновой смеси по степени очистки и обработки. Здесь выделяют 3 основные типа протеина:

  • концентрат, содержащий от 60 до 80 % чистого белка,
  • изолят, включающий до 95 % белка,
  • гидролизат, являющийся даже не просто 95-100% протеином, но и предварительно расщепленным ферментами до ди- и трипептидов, что повышает легкость и скорость усвоения.

Кроме белков в составе концентрата (и в ничтожных  количествах – изолята) присутствуют углеводы и жиры. Как правило, они не сильно ухудшают свойства протеина. Необходимо лишь следить, чтобы чистого белка в добавке не было меньше 70-75 %.

2. Аминокислотный состав хорошего протеина должен восполнять потребность организма в незаменимых аминокислотах. Их всего 9:

  1. лейцин,
  2. изолейцин и
  3. валин (вместе называемые BCAA),
  4. гистидин,
  5. лизин,
  6. метионин,
  7. треонин,
  8. фенилаланин и
  9. триптофан.

Сывороточный протеин имеет практически оптимальный состав аминокислот. Ниже нормы в нем только содержание гистидина и треонина. В этом белке также мало аргинина, важной аминокислоты, относящейся к частично заменимым.

Комплексный протеин решает эту проблему. В него входят разные по аминокислотному составу белки, которые дополняют друг друга, образуя смесь с идеальным аминокислотным профилем.

Еще одна проблема связана с тем, что недобросовестные производители могут добавлять в протеиновые смеси удешевляющие добавки (соевый белок, лецитин, большое количество эмульгаторов, пеногасителей, подсластителей и т.п.) Содержание белка (точнее незаменимых аминокислот) в таком протеине будет ниже и его анаболические качества будут хуже. Поэтому приобретать хороший сывороточный протеин следует только у проверенных добросовестных производителей.

Какой протеин оптимален?

Для ответа на этот вопрос необходимо понимать, для чего спортсмен планирует использовать протеин, какие он ставит перед собой цели.

1. К примеру, для набора массы можно особо не привередничать: подойдет практически любой сывороточный протеин, купить который Вы сможете. Главное тут – общее количество белка. Но даже если в смеси его будет меньше, можно просто взять чуть больше порцию.

2. А вот если Вы сушитесь, или стремитесь похудеть – вот тут лучше выбрать изолят, поскольку в нем меньше остаточных углеводов и жиров. Кстати, и тем, кто страдает непереносимостью лактозы, лучше тоже выбирать изолят, поскольку в нем полностью отсутствует молочный сахар. Состав изолята протеина, как мы уже говорили, более очищенный, белка в нем более 95 %.

Если говорить об аминокислотном профиле, то наилучшим выбором будет мульти протеин, или казеин – в них все незаменимые аминокислоты присутствуют в необходимых количествах. Если Вы не хотите вдаваться в подробности, то смотрите на содержание аминокислот BCAA. Состав молочного протеина (сывороточного и казеина) в этом отношении всегда на уровне, в отличие, скажем, от яичного или говяжьего. BCAA являются главными анаболическими аминокислотами – именно они активно подавляют катаболическое разрушение мышц и стимулируют синтез белка в мышечных клетках.

Поскольку состав протеина whey protein характеризуется низким количеством аргинина, то если Вы употребляете сывороточный протеин перед тренировкой, то обязательно принимайте аргинин дополнительно, поскольку именно аргинин усиливает пампинг и улучшает кровоснабжение мышц, то есть обеспечивает лучшее снабжение мышц кислородом и питательными веществами, а также более быстрое удаление шлаков и молочной кислоты.

Итак, состав протеина whey (сывороточного) обеспечивает хороший рост сухой мышечной массы, поскольку в нем присутствует достаточное количество незаменимых аминокислот (особенно BCAA), а также своевременное восстановление после тренировок.

Какие бывают виды протеина и зачем его принимать? – Москва 24, 01.12.2018

Обозреватель портала Москва 24, фитнес-эксперт и телеведущий Эдуард Каневский рассказывает, какие существуют виды протеина. Так что читаем и подбираем тот, который подойдет именно нам.

Фото: depositphotos/Wavebreakmedia

У профессиональных тренеров есть такое выражение: мышцы растут на диване. Любой новичок или человек, который вообще никогда не занимался в тренажерном зале, сначала воспринимает данные слова с изумлением, а потом и энтузиазмом. Это так здорово – лежать, ничего не делать, а вместо живота будут расти мышцы!

Расти-то они действительно будут, но при соблюдении одного важного правила: сначала нужно как следует потренироваться, создать условия для роста мышц, а уже потом во время отдыха они восстанавливаются и увеличиваются в объемах. И этот процесс не такой быстрый, как хотелось бы многим новичкам, но если заниматься регулярно, результат не заставит себя ждать.

Чтобы в период "диванного" отдыха мышцы восстанавливались и становились больше, важно вовремя и в нужном количестве употреблять главный "строительный материал" для них, а именно – белки, или протеины.

И их должно быть много, до 1,5-2 граммов протеина на килограмм веса. И те, кто хотя бы раз пытались "набрать" такое количество белка из обычных продуктов, знают, что в таком случае приходится постоянно есть. Вот именно с целью уменьшения количества приемов пищи и более быстрого усвоения белка и был придуман такой вид спортивного питания, как протеины.

Что же это такое, не "химия" ли это? Вопрос уместный, поэтому нам важно не только разобраться, что же такое протеины, но и какие их виды бывают вообще и какой может подойти именно вам.

Фото: depositphotos/KostyaKlimenko

Протеин – это белок в такой концентрации, что за один прием вы получаете количество, необходимое для подпитки ваших мышц после тренировки, во время сна или в период, когда у вас большие перерывы между приемами пищи. Собственно, мы сейчас сразу и разобрались, когда пить протеин. Как правило, это одна-две порции в день.

Так как же его получают? Если это хороший бренд (так как на рынке спортивного питания так же попадаются некачественные марки), то протеин получают заводским способом, путем отделения (фильтрации) от чистого белка балластных веществ: углеводов, жиров и прочих соединений. То есть остается практически чистый белок (концентрат). И в дальнейшем протеин могут обогащать разными питательными веществами, витаминами, а также добавляют ароматизаторы для улучшения вкусовых свойств. Сам протеин смешивают с водой, молоком или соком в шейкере или взбивают в блендере.

Каким бывает протеин?

Сывороточный – это самый распространенный вид, делают его из сыворотки молока. Он бывает нескольких видов:

– обычный сывороточный протеин (как правило, на банках пишут Whey protein). Его особенностью является то, что в составе, помимо белка, есть небольшое количество углеводов и жиров. Такой протеин идеально подходит как дополнительный источник белка в промежутках между приемами пищи.

– сывороточный изолят (Iso whey). Это протеин, полностью очищенный от других веществ. Особенностью такого белка является скорость его усвоения: она максимально большая, в отличие от обычного протеина. Данный вид белка идеально подходит для приема сразу после тренировки.

– казеиновый протеин (casein). Это вид белка, особенностью которого является скорость усвоения: благодаря более сложной молекулярной структуре, белок расщепляется дольше обычного протеина, постоянно подпитывая ваши мышцы. Такой тип идеально подходит для приема перед сном.

Фото: depositphotos/Syda_Productions

– часто взрослые люди имеют так называемую непереносимость лактозы (молочный сахар, который может вызывать и аллергические реакции). Для таких людей был выпущен безлактозный сывороточный протеин, который будет являться отличной альтернативой обычному протеину по полезным свойствам без проблем для здоровья.

Поговорим про яичный протеин (egg protein) на основе яичного белка. Доказано, что аминокислотный состав яичного белка наилучшим образом усваивается нашим организмом. Именно по этой причине профессиональные бодибилдеры употребляют яичные белки десятками в сутки. Плюс, в яичном протеине нет жиров и углеводов, что делает его полезнее. Единственным минусом такого протеина является цена, ведь он гораздо дороже протеина на сывороточной основе.

Есть и соевый протеин (soy protein) – отличный вид протеина для вегетарианцев, которых, в том числе, среди спортсменов, становится все больше.

Кнопляный протеин (hemp protein) – еще экзотичный, но уже продающийся в России вид протеина. Несмотря на название, данный протеин является отличным вариантом и конкурентом другим видам. И не зря! Ведь помимо хорошо усвояемого белка, в конопляном протеине много витаминов, минералов, омега-3 и омега-6 жиров, что делает его по-настоящему полезным.

И, наконец, говяжий протеин (beef protein) – пожалуй, самый необычный вид, который я пробовал лично. Производители утверждают, что такой вид белка отлично усваивается и дает лучше результат в приросте мышечной массы, в отличие от других видов протеина. Все возможно, но лично меня сильно смутил вкус, который активно "разбавляют" разного рода ароматизаторами. Только представьте себе говядину со вкусом малины! И, действительно, когда делаешь себе такой напиток, вкусовые свойства кажутся очень странными, даже неприятными. Но, это мое мнение, возможно, именно вам понравится данный вид протеина, и с ним ваши результаты станут лучше.

Статьи о спортивном питании. Заказать спортивное питание Meal to Goal

Привет, друзья! Если вы здесь - значит у вас есть цели!

В предыдущих статьях мы разобрали с вами процесс производства молочных белков. А также поговорили о свойствах и видах казеина. В этой статье мы поговорим о сывороточном белке.

По праву одним из самых популярных протеинов в спортивном и здоровом питании считается сывороточный протеин. И написать о нем можно много, но мы пока остановимся на основных понятиях, свойствах и преимуществах.

Сывороточный белок это  источник незаменимых аминокислот. Богатый набор аминокислот является строительным материалом для роста мышц. И при определенном режиме потребления это также и помощник в сжигании жира.

Благодаря составу аминокислот сывороточный протеин является важным ингредиентом не только для достижения спортивных результатов, но также известно его свойство повышать иммунную защиту человека. Дело в том, что одним из основных свойств сывороточного протеина является его способность повышать уровень глутатиона, который регулирует работу иммунной системы человека, а также является антиоксидантом.

Сывороточный белок - источник серы, которая содержит аминокислоту цистеин. Как раз таки цистеин способствует синтезу глутатиона. Повышенный глутатион оказывает влияние на на экспрессию генов, таким образом способствуя росту мышц. Снижение уровня глутатиона также связано с синдромом перетренированности, в связи с этим  сывороточный протеин призван предупредить или смягчить это состояние.

Что касается видов сывороточного протеина, то разговор идет опять же о концентратах, изолятах и гидролизатах.

Концентрат сывороточного белка содержит не более 85% белка в своем составе. Что влияет на его стоимость и делает дешевле по сравнению с изолятом или же гидролизатом. Но концентрат содержит большее количество лактозы и жира по сравнению с теми же изолятом и гидролизатом. Усваивается этот белок за 4 часа.

Изолят сывороточного протеина содержит более 85% белка, и содержит меньше лактозы и жира. В виду этого это вариант для тех, кто не переносит лактозу.

Гидролизат - это частично расщепленный ферментами белок, что способствует более быстрому усвоению. Чем выше степень гидролиза, тем быстрее усваивается белок.

Теперь вы знаете об основных свойствах молочных протеинов. Осталось дело за малым - купить их! Добро пожаловать в наш on-line магазин.

Команда M2G

Статьи о спортивном питании. Заказать спортивное питание Meal to Goal

Вы - в нашем онлайн магазине 😉 Точно знаете, что для поддержания здорового и спортивного образа жизни вам нужен дополнительный белок, поэтому вы хотите купить протеин. Но не знаете какой! Давайте разбираться вместе.

Чтобы определить нужный вам протеин, важно разобраться с целью, временем и способами приема протеина. Но для начала сделаем краткий обзор основных видов встречающихся на рынке протеинов и их свойств.

Основные виды протеинов и их свойства


Яичные протеины

Яичный белок (протеин) считается эталоном белков по своему составу и усвояемости. К недостаткам данного протеина относятся его специфический яичный вкус и относительно высокая цена. Поэтому продукт будет не самым лучшим выбором для приготовления протеиновых коктейлей, но отлично подойдет в качестве ингредиента при приготовлении полезных блюд.

Молочные протеины

Сывороточный протеин концентрат – самый распространенный в мире протеин для использования в спортивном питании. Он содержит в своем составе около 80% белка (но не более 85%), относительно быстро усваивается и в общем подходит для использования практически в любое время дня и практически для любых целей – будь то похудение, набор массы, восстановление и т.д.

Сывороточный протеин изолят – быстро набирающий популярность в мире протеин. Он отличается от концентрата сывороточного белка более высоким содержанием протеина – более 85%. В результате уменьшается содержание небелковой части продукта, которая включает жиры и лактозу. Данный продукт для тех, кто не переносит лактозу или тех, кто стремится максимально снизить потребление жиров.

Гидролизат сывороточного протеина – это частично расщепленный ферментами белок, что способствует его максимально быстрому усвоению. Гидролизат является  лидером среди протеинов по скорости усвоения, что и определяет его основное использование – сразу после тренировки на набор мышечной массы.

Казеин – это молочный протеин с самой низкой скоростью усваивания. Белок поступает в организм равномерно и в течение продолжительного времени. Этот продукт будет хорош при длительных перерывах в приемах пищи, а также для приема в вечернее время.

Подробно о производстве различных видов протеинов из молока вы можете прочитать в нашей статье: Производство молочных белков (Протеинов)

Растительные протеины

К растительным протеинам относятся гороховые, рисовые, конопляные, пшеничные, соевые белки, а также их смеси. Эти протеины могут быть рекомендованы для людей с непереносимостью лактозы, а также тех, кто стремится исключить из своего рациона продукты животного происхождения - вегетарианцы и веганы. Недостатками растительных протеинов является их плохие вкусовые характеристики, менее качественный, по сравнению с молочными и яичными протеинами, аминокислотный состав и низкая усвояемость.


Теперь переходим к целям, времени и способам приема протеина.

Цели, время и способы приема протеина


Цель - Похудение

При похудении вы пересматриваете свои физическую нагрузку и рацион питания. Вот тут-то и поможет протеин. Можно использовать протеиновые коктейли в качестве перекуса - насыщение и ощущение сытости от них гораздо больше, чем от углеводных перекусов. Кроме этого, коктейль с протеином - отличная альтернатива сладкому, если хочется перекусить. Также, протеин можно добавлять в пищу при приготовлении, он может заменить часть муки или же просто добавит белка в ваш продукт, что сделает прием пищи, опять же, более сытным. При похудении вы добавляете физическую нагрузку, поэтому необходимо восполнять запасы белка в организме, чтобы энергия расходовалась из жировых запасов. Все это относится к сывороточному протеину концентрату.

Еще одно преимущество протеина, но в данном случае уже казеина, при похудении, это его прием в вечернее время. Приняв казеин вечером/на ночь, вы избавитесь от чувства голода, а также, за счет долгого времени усвоения, насытите свой организм на продолжительное время. Более подробно о казеине смотрите в видео на нашем канале в Youtube.

При более скрупулезном подсчете суточного потребления калорий или же низкоуглеводной или безжировой диете можно выбрать протеин, ориентируясь именно на эти показатели, а именно максимальное содержание белка и минимум жира и углеводов. В данном случае это будет протеин сывороточный изолят.

Цель - Набор мышечной массы

Как известно, белок, он же протеин, является строительным материалом для наших тканей, мышц. При целенаправленном наращивании мышечной массы необходимо увеличивать прием белка. В виду этого, можно добавлять сывороточный протеин концентрат или изолят к привычной пище.

Для более быстрого поступления белка к мышцам после тренировки выбирайте протеин сывороточный гидролизат, у которого время усвоения является самым коротким.

Ночью мы растем! Помните это из детства? Так вот наши мышцы и ночью продолжают расти, а подпитать их можно, приняв казеиновый коктейль перед сном.

Цель - Восстановление

Восстановление происходит в период покоя. Помогите восстановиться вашим мышцам и организму, приняв сывороточный протеин концентрат или изолят после тренировки, или казеин вечером перед сном. Участвуя в восстановлени организма протеин также оказывает положительное влияние на иммуностимулирующую функцию.

Время приема:

·         с утра,

·         между приемами пищи или в качестве перекуса,

·         до тренировки,

·         после тренировки (основной прием),

·         на ночь.

Выбирая время приема, отталкивайтесь от целей, а также смотрите на время усвоения протеина организмом.

Способы приема:

·         чистый протеиновый коктейль на воде или молоке,

·         добавка к пище,

·         ингредиент в составе продукта.

Обратите внимание на то, что наши протеины предлагаются в двух вариантах - Instant и Standard. Протеины линейки Instant обладают лучшими размешиваемостью и растворимостью, а также меньшим пенообразованием  по сравнению с линейкой Standard. Поэтому, если вы предпочитаете только простые протеиновые коктейли, разведенные на воде, выбирайте Instant. Для коктейлей на молоке и остального использования вы практически не заметите разницы между Standard и Instant, поэтому продукты Standard будут целесообразнее. На нашем канале есть специальное видео о растворимости!


А теперь сведем всю эту информацию в таблицу в привязке к протеинам Meal2Goal.


И в заключении - не забывайте о том, что полное понимание того, какой продукт и когда нужно использовать, в любом случае, придет только с опытом, а на начальном этапе самым лучшим советчиком для вас будет ваш тренер.

Соевый протеин | Соевый белок | Сойка

Соевый протеин | Соевый белок | Сойка | Сойкапедия
Соевый протеин - (protein — белок) — это продукт глубокой переработки соевых бобов, позволяющей довести содержание белка в конечном продукте до 90-94% и является одним из самых коммерчески значимых и широко производимых в мире изолированных белков (наряду с глютеном, казеином и сывороточным белком). Соевый белок по составу незаменимых аминокислот почти идентичен белкам животного происхождения и практически не уступает им по питательности, пищевой ценности и усвояемости. Более того, он содержит более высокий процент некоторых аминокислот (глютамина, лизина, аргинина и аминокислот с разветвленными цепочками), чем высококачественные животные протеины, в том числе сывороточный, яичный и казеин.

Уникальными свойствами соевого протеина являются способность снижать холестерин в крови, а также удерживать кальций в костях. По рекомендации FDA, 25г соевого белка в день, как часть диеты с низким содержанием жира и холестерина, снижают риск сердечно-сосудистых заболеваний. Связанные с белком изофлавоны сои блокируют рост раковых клеток, поэтому в настоящее время компании, специализирующиеся в области увеличения продолжительности жизни, рекомендуют использовать изолят соевого белка для лечения некоторых видов рака.

Именно поэтому соевые белки сегодня широко используются в качестве ингредиентов в производстве многих специализированных продуктов. На основе соевого протеина изготавливают детское питание для грудничков-аллергиков, белковые смеси для спортивного питания, соевые молочные продукты с заданными свойствами, продукты функционального питания, используют в мясоперерабатывающей промышленности для улучшения сочности изделий и многих других целей.

Места производства: США, Китай.

Кулинарные свойства: В системе общественного питания соевый протеин может быть использован для приготовления белковых коктейлей и обогащения полноценным белком любых блюд. Соевый белок прекрасно заменяет кукурузный крахмал в выпечке и десертах. Розничный потребитель также может ввести соевый протеин в свое ежедневное меню для тех же целей – это бюджетный вариант оздоровления рациона семьи.

Белки - Свойства, структура, классификация и функции - Биохимия

  • Белки - это самые распространенные биологические макромолекулы, встречающиеся во всех клетках.
  • Это также самая универсальная органическая молекула среди живых систем, которая встречается в большом количестве; тысячи различных видов, от относительно небольших пептидов до крупных полимеров.
  • Белки представляют собой полимеры аминокислот, ковалентно связанных пептидными связями.
  • Строительными блоками белков являются двадцать встречающихся в природе аминокислот.
  • Таким образом, белки представляют собой полимеры аминокислот.

Свойства белков

Растворимость в воде
  • Взаимоотношения белков с водой сложны.
  • Вторичная структура белков во многом зависит от взаимодействия пептидных связей с водой через водородные связи.
  • Водородные связи образуются также между белком (альфа- и бета-структуры) и водой. Богатый белком статический шар более растворим, чем спиральные структуры.
  • В третичной структуре вода вызывает ориентацию цепей и гидрофильных радикалов за пределы молекулы, в то время как гидрофобные цепи и радикалы имеют тенденцию реагировать друг с другом внутри молекулы (гидрофобный эффект).

Денатурация и ренатурация
  • Белки могут быть денатурированы такими агентами, как нагревание и мочевина, которые вызывают разворачивание полипептидных цепей, не вызывая гидролиза пептидных связей.
  • Денатурирующие агенты разрушают вторичные и третичные структуры, не затрагивая первичную структуру.
  • Если денатурированный белок возвращается в свое естественное состояние после удаления денатурирующего агента, этот процесс называется ренатурацией.

Некоторые денатурирующие агенты включают

Физические агенты : Тепло, излучение, pH

Химические вещества : Раствор мочевины, который образует новые водородные связи в белке, органических растворителях, детергентах.

Коагуляция

Когда белки денатурируются под действием тепла, они образуют нерастворимые агрегаты, известные как коагулят.Все белки не коагулируются при нагревании, только некоторые из них, такие как альбумины, глобулины способны коагулироваться при нагревании.

Изоэлектрическая точка
  • Изоэлектрическая точка (pI) - это pH, при котором количество положительных зарядов равно количеству отрицательных зарядов, а общий заряд аминокислоты равен нулю.
  • В этот момент под воздействием электрического поля белки не перемещаются ни к аноду, ни к катоду, следовательно, это свойство используется для выделения белков.

Молекулярная масса белков
  • Средняя молекулярная масса аминокислоты принята равной 110.
  • Общее количество аминокислот в белке, умноженное на 110, дает приблизительную молекулярную массу этого белка.
  • Различные белки имеют разный аминокислотный состав и, следовательно, их молекулярные массы различаются.
  • Молекулярная масса белков колеблется от 5000 до 10 9 Дальтон.

Посттрансляционные модификации
  • Это происходит после того, как белок был синтезирован на рибосоме.
  • Фосфорилирование, гликозилирование, рибозилирование АДФ, метилирование, гидроксилирование и ацетилирование влияют на заряд и взаимодействия между аминокислотными остатками, изменяя трехмерную конфигурацию и, таким образом, функцию белка.

Химические свойства

1. Биуретовый тест :

При добавлении 2 мл исследуемого раствора к равному объему 10% NaOH и одной капли 10% раствора CuSO4 образование фиолетового цвета указывает на присутствие пептидной связи.

2. Тест на нингидрин:

Когда 1 мл раствора нингидрина добавляют к 1 мл раствора белка и нагревают, образование фиолетового цвета указывает на присутствие α-аминокислот.

  • Линейная последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи определяет трехмерную конфигурацию белка, а структура белка определяет его функцию.
  • Все белки содержат элементы углерод, водород, кислород, азот и серу, некоторые из них могут также содержать фосфор, йод и следы металлов, таких как ион, медь, цинк и марганец.
  • Белок может содержать 20 различных видов аминокислот. Каждая аминокислота имеет аминогруппу на одном конце и кислотную группу на другом, а также отличительную боковую цепь.
  • Основная цепь одинакова для всех аминокислот, в то время как боковая цепь отличается от одной аминокислоты к другой.

Строение белков можно разделить на четыре уровня организации:

1. Первичная структура

  • Первичная структура белка состоит из аминокислотной последовательности вдоль полипептидной цепи.
  • Аминокислоты соединены пептидными связями.
  • Поскольку в пептидных связях нет диссоциируемых протонов, заряды на полипептидной цепи обусловлены только N-концевой аминогруппой, C-концевой карбоксильной группой и боковыми цепями аминокислотных остатков.
  • Первичная структура определяет дальнейшие уровни организации белковых молекул.

2. Вторичная структура

  • Вторичная структура включает различные типы локальных конформаций, в которых атомы боковых цепей не участвуют.
  • Вторичные структуры образованы регулярным повторяющимся паттерном образования водородных связей между атомами основной цепи.
  • Вторичная структура включает α-спирали, β-листы и другие типы схем складывания, которые возникают из-за регулярного повторяющегося паттерна образования водородных связей.
  • Вторичная структура белка может быть:
  1. Альфа-спираль
  2. Бета-спираль
  • α-спираль представляет собой правую спиральную нить.
  • Заместители боковых цепей аминокислотных групп в α-спирали простираются наружу.
  • Водородные связи образуются между кислородом C = O каждой пептидной связи в цепи и водородом группы N-H пептидной связи на четыре аминокислоты ниже нее в спирали.
  • Заместители боковых цепей аминокислот подходят рядом с группами N-H.
  • Водородная связь в ß-листе находится между нитями (между нитями), а не внутри нитей (внутри нитей).
  • Конформация листа состоит из пар прядей, лежащих бок о бок.
  • Карбонильные атомы кислорода в одной цепи водородной связи с атомами водорода соседней цепи.
  • Две нити могут быть параллельны или антипараллельны, в зависимости от того, совпадают ли направления нитей (от N-конца до C-конца).
  • Антипараллельный ß-лист более стабилен из-за более хорошо выровненных водородных связей.

3. Третичная структура

  • Третичная структура белка относится к его общей трехмерной конформации.
  • Типы взаимодействий между аминокислотными остатками, которые создают трехмерную форму белка, включают гидрофобные взаимодействия, электростатические взаимодействия и водородные связи, все из которых нековалентны.
  • Также встречаются ковалентные дисульфидные связи.
  • Он образуется в результате взаимодействий между аминокислотными остатками, которые могут находиться на значительном расстоянии друг от друга в первичной последовательности полипептидной цепи.
  • Гидрофобные аминокислотные остатки имеют тенденцию скапливаться внутри глобулярных белков, где они исключают воду, тогда как гидрофильные остатки обычно находятся на поверхности, где они взаимодействуют с водой.

4. Четвертичная структура

  • Четвертичная структура относится к взаимодействию одной или нескольких субъединиц с образованием функционального белка с использованием тех же сил, которые стабилизируют третичную структуру.
  • Это пространственное расположение субъединиц в белке, состоящем из более чем одной полипептидной цепи.

Классификация белков

На основании химической природы, структуры, формы и растворимости белки классифицируются как:

  1. Простые белки : они состоят только из аминокислотных остатков.При гидролизе эти белки дают только составляющие аминокислоты. Далее он делится на:
    • Волокнистый белок: кератин, эластин, коллаген
    • Глобулярный белок: альбумин, глобулин, глутелин, гистоны
  2. Конъюгированные белки : они объединены небелковой частью. Например. Нуклеопротеин, фосфопротеин, липопротеин, металлопротеин и т. Д.
  3. Производные белки : это производные или продукты разложения простых и конъюгированных белков.Они могут быть :
    • Первичный производный белок: протеины, метапротеины, коагулированные белки
    • Белки вторичного происхождения: протеозен или альбунозы, пептоны, пептиды.

Функции белков

Белки жизненно важны для роста и восстановления, и их функции безграничны. Они также обладают огромным разнообразием биологических функций и являются наиболее важными конечными продуктами информационных путей.

  • Белки, состоящие из аминокислот, выполняют множество функций в организме (например,g., как ферменты, структурные компоненты, гормоны и антитела).
  • Они действуют как структурные компоненты, такие как кератин волос и ногтей, костный коллаген и т. Д.
  • Белки - это молекулярные инструменты, с помощью которых выражается генетическая информация.
  • Они выполняют свою деятельность по переносу кислорода и углекислого газа с помощью гемоглобина и специальных ферментов в красных кровяных тельцах.
  • Они функционируют в гомостатическом контроле объема циркулирующей крови и интерстициальных жидкостей через белки плазмы.
  • Они участвуют в свертывании крови через тромбин, фибриноген и другие белковые факторы.
  • Они действуют как защита от инфекций с помощью белковых антител.
  • Они осуществляют наследственную передачу нуклеопротеидами ядра клетки.
  • Овальбумин, глютелин и др. Являются запасными белками.
  • Актин, миозин действует как сократительный белок, важный для сокращения мышц.

Список литературы
  1. Смит, К.М., Маркс, А. Д., Либерман, М. А., Маркс, Д. Б., и Маркс, Д. Б. (2005). Базовая медицинская биохимия Марка: клинический подход. Филадельфия: Липпинкотт Уильямс и Уилкинс.
  2. Родуэлл, В. В., Ботам, К. М., Кеннелли, П. Дж., Вейл, П. А., и Бендер, Д. А. (2015). Иллюстрированная биохимия Харпера (30-е изд.). Нью-Йорк, Нью-Йорк: McGraw-Hill Education LLC.
  3. Джон У. Пелли, Эдвард Ф. Гольян (2011). Биохимия. Третье издание. Филадельфия: США.
  4. https: // химия.tutorvista.com/biochemistry/proteins.html
  5. http://www.biologydiscussion.com/proteins/proteins-definition-importance-and-classification-biochemistry/41903
  6. https://www.particlesciences.com/news/technical-briefs/2009/protein-structure.html
  7. http://www.biologydiscussion.com/proteins/proteins-functions-structure-properties-and-classification/16912

Структурные и функциональные свойства спайкового белка SARS-CoV-2: разработка потенциального антивирусного препарата для COVID-19

  • 1.

    Zhu N, Zhang D, Wang W, Li X, Yang B, Song J и др. Новый коронавирус от пациентов с пневмонией в Китае, 2019. N Engl J Med. 2020; 382: 727–33.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 2.

    Wu C, Liu Y, Yang Y, Zhang P, Zhong W, Wang Y, et al. Анализ терапевтических целей для SARS-CoV-2 и открытие потенциальных лекарств с помощью вычислительных методов. Acta Pharm Sin B. 2020; 10: 766–88.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 3.

    Лю Ц., Чжоу К., Ли И, Гарнер Л.В., Уоткинс С.П., Картер Л.Дж. и др. Исследования и разработки терапевтических агентов и вакцин против COVID-19 и связанных с ним заболеваний, связанных с коронавирусом человека. ACS Cent Sci. 2020; 6: 315–31.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 4.

    Сандерс Дж. М., Моног М. Л., Йодловски Т. З., Катрелл Дж. Б.. Фармакологические методы лечения коронавирусной болезни 2019 (COVID-19): обзор. ДЖАМА. 2020; 323: 1824–36.

    CAS Google ученый

  • 5.

    Лу Р, Чжао X, Ли Дж, Ниу П, Ян Б., Ву Х и др. Геномная характеристика и эпидемиология нового коронавируса 2019 года: значение для происхождения вируса и связывания с рецептором. Ланцет. 2020; 395: 565–74.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 6.

    Chen L, Liu W., Zhang Q, Xu K, Ye G, Wu W. и др. Подход mNGS на основе РНК позволяет идентифицировать новый коронавирус человека из двух отдельных случаев пневмонии во время вспышки в Ухане в 2019 году.Emerg Microbes Infect. 2020; 9: 313–9.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 7.

    Чан Дж. Ф., Кок К. Х., Чжу З., Чу Х, То К. К., Юань С. и др. Геномная характеристика нового патогенного для человека коронавируса 2019 года, выделенного от пациента с атипичной пневмонией после посещения Ухани. Emerg Microbes Infect. 2020; 9: 221–36.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 8.

    Letko M, Marzi A, Munster V. Функциональная оценка входа в клетки и использования рецепторов для SARS-CoV-2 и других бета-коронавирусов линии B. Nat Microbiol. 2020; 5: 562–9.

    CAS Google ученый

  • 9.

    Фер А.Р., Перлман С. Коронавирусы: обзор их репликации и патогенеза. Методы Мол биол. 2015; 1282: 1–23.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 10.

    Морс Дж.С., Лалонд Т, Сюй С, Лю WR. Уроки прошлого: возможные варианты срочной профилактики и лечения тяжелых острых респираторных инфекций, вызванных 2019-nCoV. Chembiochem. 2020; 21: 730–8.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 11.

    Bosch BJ, van der Zee R, de Haan CA, Rottier PJ. Белок-спайк коронавируса представляет собой гибридный белок вируса класса I: структурная и функциональная характеристика комплекса ядра слияния.J Virol. 2003; 77: 8801–11.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 12.

    Ватанабе Ю., Аллен Дж. Д., Рэпп Д., МакЛеллан Дж. С., Криспин М. Сайт-специфический гликановый анализ шипа SARS-CoV-2. Наука. 2020; 369: 330–3.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 13.

    Xia S, Zhu Y, Liu M, Lan Q, Xu W., Wu Y, et al. Механизм слияния 2019-nCoV и ингибиторов слияния, нацеленных на домен HR1 в спайковом белке.Cell Mol Immunol. 2020; 17: 765–7.

    PubMed CAS Google ученый

  • 14.

    Тан Т., Бидон М., Джеймс Дж. А., Уиттакер Г. Р., Дэниел С. Механизм слияния мембран коронавируса представляет собой потенциальную мишень для противовирусных разработок. Antivir Res. 2020; 178: 104792.

    PubMed CAS Google ученый

  • 15.

    Wrapp D, Wang N, Corbett KS, Goldsmith JA, Hsieh CL, Abiona O, et al.Крио-ЭМ структура спайка 2019-нКоВ в конформации до слияния. Наука. 2020; 367: 1260–3.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 16.

    Walls AC, Park YJ, Tortorici MA, Wall A, McGuire AT, Veesler D. Структура, функция и антигенность гликопротеина шипа SARS-CoV-2. Клетка. 2020; 181: 281–92 e286.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 17.

    Bertram S, Dijkman R, Habjan M, Heurich A, Gierer S, Glowacka I, et al. TMPRSS2 активирует человеческий коронавирус 229E для катепсин-независимого входа в клетки-хозяева и экспрессируется в вирусных клетках-мишенях в респираторном эпителии. J Virol. 2013; 87: 6150–60.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 18.

    Hoffmann M, Kleine-Weber H, Schroeder S, Kruger N, Herrler T., Erichsen S, et al. Вход в клетки SARS-CoV-2 зависит от ACE2 и TMPRSS2 и блокируется клинически доказанным ингибитором протеазы.Клетка. 2020; 181: 271–80.e8.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 19.

    Du L, Kao RY, Zhou Y, He Y, Zhao G, Wong C и др. Расщепление спайкового белка коронавируса SARS протеазным фактором Ха связано с вирусной инфекционностью. Biochem Biophys Res Commun. 2007; 359: 174–9.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 20.

    Ван Кью, Чжан И, Ву Л., Ниу С., Сонг С, Чжан Зи и др.Структурная и функциональная основа проникновения SARS-CoV-2 с использованием человеческого ACE2. Клетка. 2020; 181: 894–904.e9.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 21.

    Лан Дж., Дж. Дж., Ю Дж., Шань С., Чжоу Х., Фань С. и др. Структура спайк-связывающего домена SARS-CoV-2, связанного с рецептором ACE2. Природа. 2020; 581: 215–20.

    PubMed CAS Google ученый

  • 22.

    Xia S, Yan L, Xu W., Agrawal AS, Algaissi A, Tseng CK, et al. Ингибитор слияния пан-коронавируса, нацеленный на домен HR1 спайка коронавируса человека. Sci Adv. 2019; 5: eaav4580.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 23.

    Миллет Дж. К., Уиттакер ГР. Физиологические и молекулярные триггеры слияния мембран SARS-CoV и проникновения в клетки-хозяева. Вирусология. 2018; 517: 3–8.

    PubMed CAS Google ученый

  • 24.

    Chambers P, Pringle CR, Easton AJ. Последовательности гептадных повторов расположены рядом с гидрофобными участками в нескольких типах гликопротеинов слияния вирусов. J Gen Virol. 1990; 71: 3075–80.

    PubMed CAS Google ученый

  • 25.

    Робсон Б. Компьютеры и вирусные болезни. Предварительные биоинформатические исследования по разработке синтетической вакцины и профилактического пептидомиметического антагониста против коронавируса SARS-CoV-2 (2019-nCoV, COVID-19).Comput Biol Med. 2020; 119: 103670.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 26.

    Xia S, Xu W., Wang Q, Wang C, Hua C, Li W, et al. Ингибиторы слияния мембран на основе пептидов, нацеленные на домены HR1 и HR2 шипового белка HCoV-229E. Int J Mol Sci. 2018; 19: 487. https://doi.org/10.3390/ijms187.

    Артикул PubMed Central CAS Google ученый

  • 27.

    Лу Г, Ван Кью, Гао ГФ. От летучей мыши к человеку: особенности всплеска, определяющие «скачок от хозяина» коронавирусов SARS-CoV, MERS-CoV и других. Trends Microbiol. 2015; 23: 468–78.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 28.

    Лю С., Сяо Дж., Чен Й, Хе Й, Ниу Дж., Эскаланте С. Р. и др. Взаимодействие между участками 1 и 2 гептадных повторов в спайковом белке коронавируса, связанного с SARS: влияние на механизм слияния вируса и идентификация ингибиторов слияния.Ланцет. 2004; 363: 938–47.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 29.

    Yu Y, Deng YQ, Zou P, Wang Q, Dai Y, Yu F и др. Вирусный инактиватор на основе пептидов подавляет вирусную инфекцию Зика у беременных мышей и плодов. Nat Commun. 2017; 8: 15672.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 30.

    Weissenhorn W., Dessen A, Calder LJ, Harrison SC, Skehel JJ, Wiley DC.Структурная основа слияния мембран вирусами в оболочке. Mol Membr Biol. 1999; 16: 3–9.

    PubMed CAS Google ученый

  • 31.

    Gui M, Song W, Zhou H, Xu J, Chen S, Xiang Y, et al. Структуры криоэлектронной микроскопии гликопротеина шипа SARS-CoV выявляют предварительное конформационное состояние для связывания рецептора. Cell Res. 2017; 27: 119–29.

    PubMed CAS Google ученый

  • 32.

    Hulswit RJ, де Хаан, Калифорния, Bosch BJ. Пиковый белок коронавируса и изменения тропизма. Adv Virus Res. 2016; 96: 29–57.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 33.

    Yan R, Zhang Y, Li Y, Xia L, Guo Y, Zhou Q. Структурная основа для распознавания SARS-CoV-2 полноразмерным человеческим ACE2. Наука. 2020; 367: 1444–8.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 34.

    Цуй Дж., Ли Ф, Ши З.Л. Происхождение и эволюция патогенных коронавирусов. Nat Rev Microbiol. 2019; 17: 181–92.

    PubMed CAS Google ученый

  • 35.

    Донохью М., Сие Ф., Баронас Э., Годбаут К., Госселин М., Стальяно Н. и др. Новая карбоксипептидаза, связанная с ангиотензинпревращающим ферментом (ACE2), превращает ангиотензин I в ангиотензин 1-9. Circ Res. 2000; 87: E1–9.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 36.

    Zhang H, Penninger JM, Li Y, Zhong N, Slutsky AS. Ангиотензин-превращающий фермент 2 (ACE2) как рецептор SARS-CoV-2: молекулярные механизмы и потенциальная терапевтическая мишень. Intensive Care Med. 2020; 46: 586–90.

    PubMed CAS Google ученый

  • 37.

    Шан Дж., Ван И, Ло Ц., Йе Г, Гэн К., Ауэрбах А. и др. Механизмы входа в клетки SARS-CoV-2. Proc Natl Acad Sci USA. 2020; 117: 11727–34.

    PubMed CAS Google ученый

  • 38.

    Чен И, Го И, Пань И, Чжао Ц. Анализ структуры рецепторного связывания 2019-nCoV. Biochem Biophys Res Commun. 2020; 525: 135–40.

    PubMed Central Google ученый

  • 39.

    Ван И, Шан Дж., Грэм Р., Барик Р.С., Ли Ф. Распознавание рецепторов новым коронавирусом из Ухани: анализ, основанный на десятилетних структурных исследованиях коронавируса SARS. J Virol. 2020; 94: e00127–20.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 40.

    Tortorici MA, Walls AC, Lang Y, Wang C, Li Z, Koerhuis D, et al. Структурная основа прикрепления коронавируса человека к рецепторам сиаловой кислоты. Nat Struct Mol Biol. 2019; 26: 481–9.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 41.

    Coutard B, Valle C, de Lamballerie X, Canard B, Seidah NG, Decroly E. Спайковый гликопротеин нового коронавируса 2019-nCoV содержит фурин-подобный сайт расщепления, отсутствующий в CoV той же клады.Antivir Res. 2020; 176: 104742.

    PubMed CAS Google ученый

  • 42.

    Rabaan AA, Al-Ahmed SH, Haque S, Sah R, Tiwari R, Malik YS, et al. SARS-CoV-2, SARS-CoV и MERS-COV: сравнительный обзор. Infez Med. 2020; 28: 174–84.

    PubMed CAS Google ученый

  • 43.

    Хасан А., Парай Б.А., Хуссейн А., Кадир Ф.А., Аттар Ф., Азиз Ф.М. и др. Обзор примирования расщепления белка-шипа на коронавирусе ангиотензин-превращающим ферментом-2 и фурином.J Biomol Struct Dyn. 2020; 22: 1–9.

    Google ученый

  • 44.

    Millet JK, Whittaker GR. Протеазы клеток-хозяев: критические детерминанты тропизма и патогенеза коронавируса. Virus Res. 2015; 202: 120–34.

    PubMed CAS Google ученый

  • 45.

    Claas EC, Osterhaus AD, van Beek R, De Jong JC, Rimmelzwaan GF, Senne DA, et al. Человеческий грипп Вирус H5N1, относящийся к высокопатогенному вирусу птичьего гриппа.Ланцет. 1998; 351: 472–7.

    PubMed CAS Google ученый

  • 46.

    Кидо Х., Окумура Ю., Такахаши Е., Пан Х.Й., Ван С., Яо Д. и др. Роль протеаз клеток хозяина в патогенезе гриппа и полиорганной недостаточности. Biochim Biophys Acta. 2012; 1824: 186–94.

    PubMed CAS Google ученый

  • 47.

    Heurich A, Hofmann-Winkler H, Gierer S, Liepold T, Jahn O, Pohlmann S.TMPRSS2 и ADAM17 по-разному расщепляют ACE2, и только протеолиз с помощью TMPRSS2 увеличивает вход, вызванный спайк-белком коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома. J Virol. 2014; 88: 1293–307.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 48.

    Limburg H, Harbig A, Bestle D, Stein DA, Moulton HM, Jaeger J, et al. TMPRSS2 является основной активирующей протеазой вируса гриппа A в первичных клетках дыхательных путей человека и вируса гриппа B в пневмоцитах человека II типа.J Virol. 2019; 93: e00649–19.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 49.

    Ou X, Liu Y, Lei X, Li P, Mi D, Ren L, et al. Характеристика спайкового гликопротеина SARS-CoV-2 при проникновении вируса и его иммунная перекрестная реактивность с SARS-CoV. Nat Commun. 2020; 11: 1620.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 50.

    Кавасэ М, Катаока М, Сирато К., Мацуяма С.Биохимический анализ конформационных промежуточных продуктов гликопротеина шипа коронавируса во время слияния мембран. J Virol. 2019; 93: e00785–19.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 51.

    Харрисон СК. Слияние вирусных мембран. Вирусология. 2015; 479-480: 498-507.

    PubMed CAS Google ученый

  • 52.

    Экерт Д.М., Ким П.С. Механизмы слияния вирусных мембран и его ингибирование.Анну Рев Биохим. 2001; 70: 777–810.

    PubMed CAS Google ученый

  • 53.

    Дхама К., Шарун К., Тивари Р., Дадар М., Малик Ю.С., Сингх К.П. и др. COVID-19, новая коронавирусная инфекция: достижения и перспективы в разработке и разработке вакцин, иммунотерапевтических и терапевтических средств. Hum Vaccin Immunother. 2020; 16: 1232–8

    PubMed CAS Google ученый

  • 54.

    Чжэн М., Сонг Л. Новые эпитопы антител доминируют в антигенности спайкового гликопротеина в SARS-CoV-2 по сравнению с SARS-CoV. Cell Mol Immunol. 2020; 17: 536–8.

    PubMed CAS Google ученый

  • 55.

    Гао Кью, Бао Л., Мао Х, Ван Л., Сюй К., Ян М. и др. Быстрая разработка инактивированной вакцины-кандидата от SARS-CoV-2. Наука. 2020; 369: 77–81.

    PubMed CAS Google ученый

  • 56.

    Coleman CM, Liu YV, Mu H, Taylor JK, Massare M, Flyer DC, et al. Очищенные наночастицы белка-шипа коронавируса индуцируют нейтрализующие антитела к коронавирусу у мышей. Вакцина. 2014; 32: 3169–74.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 57.

    Тиан Х, Ли К., Хуанг А., Ся С., Лу С., Ши Зи и др. Сильное связывание спайкового белка нового коронавируса 2019 года человеческими моноклональными антителами, специфичными для коронавируса SARS. Emerg Microbes Infect.2020; 9: 382–5.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 58.

    Ван С., Ли В., Драбек Д., Окба НМА, ван Хаперен Р., Остерхаус А. и др. Человеческое моноклональное антитело, блокирующее инфекцию SARS-CoV-2. Nat Commun. 2020; 11: 2251.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 59.

    Chen XY, Li R, Pan ZW, Qian CF, Yang Y, You RR, et al. Человеческие моноклональные антитела блокируют связывание спайкового белка SARS-CoV-2 с рецептором ангиотензинпревращающего фермента 2.Cell Mol Immunol. 2020; 17: 647–9.

    PubMed CAS Google ученый

  • 60.

    Wu Y, Li C, Xia S, Tian X, Wang Z, Kong Y и др. Идентификация полностью человеческих однодоменных антител против SARS-CoV-2. Клеточный микроб-хозяин. 2020; 27: 891–8.e5. https://doi.org/10.1101/2020.03.30.015990.

    Артикул PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 61.

    Pinto D, Park Y-J, Beltramello M, Walls AC, Tortorici MA, Bianchi S, et al. Структурный и функциональный анализ мощного нейтрализующего антитела к сарбековирусу. bioRxiv. 2020; 2020.04.07.023903. https://doi.org/10.1101/2020.04.07.023903.

  • 62.

    Ju B, Zhang Q, Ge X, Wang R, Yu J, Shan S, et al. Сильные нейтрализующие антитела человека, вызванные инфекцией SARS-CoV-2. bioRxiv. 2020; https://doi.org/10.1101/2020.03.21.9

  • .

  • 63.

    Chi X, Yan R, Zhang J, Zhang G, Zhang Y, Hao M, et al.Мощное нейтрализующее человеческое антитело обнаруживает, что N-концевой домен белка Spike SARS-CoV-2 является уязвимым местом. bioRxiv. 2020. https://doi.org/10.1101/2020.05.08.083964.

  • 64.

    Xia S, Liu MQ, Wang C, Xu W., Lan QS, Feng SL, et al. Ингибирование инфекции SARS-CoV-2 (ранее 2019-nCoV) с помощью мощного ингибитора слияния панкоронавируса, нацеленного на его спайковый белок, обладающий высокой способностью опосредовать слияние мембран. Cell Res. 2020; 30: 343–55.

    PubMed CAS Google ученый

  • 65.

    Zhu Y, Yu D, Yan H, Chong H, He Y. Разработка мощных ингибиторов слияния мембран против SARS-CoV-2, нового коронавируса с высокой фузогенной активностью. J Virol. 2020; 94: e00635–20.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 66.

    Musarrat F, Chouljenko V, Dahal A, Nabi R, Chouljenko T, Jois SD, et al. Препарат против ВИЧ Нелфинавир Мезилат (Вирасепт) является мощным ингибитором слияния клеток, вызванного гликопротеином SARS-CoV-2 Spike (S), что требует дальнейшей оценки в качестве противовирусного средства против инфекций COVID-19.J Med Virol. 2020; 10.1002 / jmv.25985.

  • 67.

    Uno Y. Терапия мезилатом Camostat для COVID-19. Intern Emerg Med. 2020; 1–2. https://doi.org/10.1007/s11739-020-02345-9. [Epub перед печатью].

  • 68.

    de Wilde AH, Falzarano D, Zevenhoven-Dobbe JC, Beugeling C, Fett C, Martellaro C, et al. Алиспоривир подавляет репликацию коронавирусов MERS и SARS в культуре клеток, но не подавляет заражение коронавирусом SARS на мышиной модели. Virus Res. 2017; 228: 7–13.

    PubMed Google ученый

  • 69.

    Huang IC, Bosch BJ, Li WH, Farzan M, Rottier PM. Choe H. SARS-CoV, но не HCoV-NL63, использует катепсины для заражения клеток - проникновение вируса. Нидовирусы: к борьбе с Sars и другими нидовирусами. Болезни. 2006; 581: 335–8.

    CAS Google ученый

  • 70.

    Zhou N, Pan T, Zhang JS, Li QW, Zhang X, Bai C, et al. Гликопептидные антибиотики сильно ингибируют катепсин L в поздних эндосомах / лизосомах и блокируют проникновение вируса Эбола, коронавируса ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ) и коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС-КоВ).J Biol Chem. 2016; 291: 9218–32.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 71.

    Нельсон Э.А., Дьялл Дж., Хоэнен Т., Барнс А.Б., Чжоу Х., Лян Дж.Й. и др. Апилимод, ингибитор фосфатидилинозитол-3-фосфат-5-киназы, блокирует проникновение филовирусов и инфицирование. PLoS Negl Trop Dis. 2017; 11: e0005540.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 72.

    Hou JZ, Xi ZQ, Niu J, Li W, Wang X, Liang C и др.Ингибирование PIKfyve с помощью YM201636 подавляет рост рака печени за счет индукции аутофагии. Онкол Реп. 2019; 41: 1971–9.

    PubMed CAS Google ученый

  • 73.

    Сакурай Ю., Колокольцов А.А., Чен С.К., Тидвелл М.В., Баута В.Е., Клугбауэр Н. и др. Двухпористые каналы контролируют проникновение вируса Эбола в клетки-хозяева и являются мишенями для лечения заболеваний. Наука. 2015; 347: 995–8.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 74.

    Артенштейн А.В., Опал СМ. Конверсии пропротеина в здоровье и болезни. N Engl J Med. 2011; 365: 2507–18.

    PubMed CAS Google ученый

  • 75.

    Хуанг Ц., Ван И, Ли Х, Рен Л., Чжао Дж, Ху Y и др. Клинические особенности пациентов, инфицированных новым коронавирусом 2019 г., в Ухане, Китай. Ланцет. 2020; 395: 497–506.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 76.

    Yakala GK, Cabrera-Fuentes HA, Crespo-Avilan GE, Rattanasopa C, Burlacu A, George BL, et al. Ингибирование ФУРИНА снижает ремоделирование сосудов и прогрессирование атеросклеротических поражений у мышей. Артериосклер Thromb Vasc Biol. 2019; 39: 387–401.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 77.

    Zhou M, Zhang Y, Wei H, He J, Wang D, Chen B и др. Ингибитор фурина D6R подавляет эпителиально-мезенхимальный переход в клетках SW1990 и PaTu8988 через сигнальный путь Hippo-YAP.Oncol Lett. 2018; 15: 3192–6.

    PubMed Google ученый

  • 78.

    Leblond J, Laprise MH, Gaudreau S, Grondin F, Kisiel W., Dubois CM. Ингибитор серпиновой протеиназы 8: эндогенный ингибитор фурина, высвобождаемый из тромбоцитов человека. Thromb Haemost. 2006; 95: 243–52.

    PubMed CAS Google ученый

  • 79.

    Лу И, Хардес К., Дамс С.О., Боттчер-Фрибертсхаузер Э., Штайнметцер Т., Тан МЭ и др.Пептидомиметический ингибитор фурина MI-701 в комбинации с осельтамивиром и рибавирином эффективно блокирует распространение высокопатогенных вирусов птичьего гриппа и задерживает высокий уровень устойчивости к осельтамивиру в клетках MDCK. Antivir Res. 2015; 120: 89–100.

    PubMed CAS Google ученый

  • 80.

    Abidin AZ, DSouza AM, Nagarajan MB, Wang L, Qiu X, Schifitto G, et al. Изменение топологии сети мозга при ВИЧ-ассоциированном нейрокогнитивном расстройстве: новая перспектива функциональной связи.Neuroimage Clin. 2018; 17: 768–77.

    PubMed Google ученый

  • 81.

    Ван Ц., Лю З., Чен З., Хуанг Х, Сюй М., Хе Т. и др. Установление эталонной последовательности для SARS-CoV-2 и вариационный анализ. J Med Virol. 2020; 92: 667–74.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • 82.

    Бесерра-Флорес М., Кардозо Т. Мутация вирусного шипа SARS-CoV-2 G614 демонстрирует более высокий уровень летальности.Int J Clin Pract. 2020; 6: e13525.

    Google ученый

  • 83.

    Zhou GY, Zhao Q. Перспективы терапевтических нейтрализующих антител против нового коронавируса SARS-CoV-2. Int J Biol Sci. 2020; 16: 1718–23.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 84.

    Wang ML, Cao RY, Zhang LK, Yang XL, Liu J, Xu MY, et al. Ремдесивир и хлорохин эффективно подавляют недавно появившийся новый коронавирус (2019-nCoV) in vitro.Cell Res. 2020; 30: 269–71.

    PubMed PubMed Central CAS Google ученый

  • Границы | Гликоинженерия протеина: подход к улучшению свойств протеина

    Введение

    С углублением нашего понимания биологии рекомбинантные белки стали важным классом биологических макромолекул, которые широко используются в медицине, промышленности, сельском хозяйстве, охране окружающей среды и других областях (Puetz and Wurm, 2019).В области медицины терапевтические белки, такие как антитела, цитокины / факторы роста и гормоны, незаменимы для профилактики и лечения рака, инфекций, аутоиммунных заболеваний, метаболических генетических заболеваний и многих других заболеваний, во многом благодаря их преимуществам. высокой специфичности, низкой токсичности и определенных биологических функций. Сейчас они являются самым быстрорастущим сегментом глобального фармацевтического рынка (Owczarek et al., 2019). Белки, которые часто используются в промышленности, сельском хозяйстве, охране окружающей среды и других связанных областях, представляют собой ферменты, в том числе амилазу, лактазу, липазу, фитазу, ксиланазу и целлюлазу.Ферменты обладают преимуществами высокой каталитической эффективности, высокой специфичности, мягких условий реакции и меньшего загрязнения. Их применение в пищевой, моющей, текстильной, бумажной, животноводческой отраслях, производстве новой энергии и утилизации отходов значительно повысило качество производимой продукции, снизило загрязнение окружающей среды и способствовало устойчивому экономическому и экологическому развитию (Arbige et al., 2019).

    Однако из-за природы биологических макромолекул у белков также есть свои проблемы.Из-за большой молекулярной массы, сложного состава и структуры многие белки обладают ограниченной растворимостью, термической и протеолитической стабильностью. Они могут быть денатурированы во время хранения или склонны к агрегации и химическим модификациям, таким как окисление и дезамидирование. Существование этих проблем может привести к снижению эффективности терапевтических белков и усилению иммуногенных побочных эффектов. Что касается ферментов, эти проблемы могут привести к их медленному развитию и высокой стоимости производства, что, в свою очередь, ограничивает их промышленное применение.Ученые много лет пытались решить эти проблемы (Sinha, Shukla, 2019). Они исследовали множество различных методов создания белков в надежде улучшить их стабильность, растворимость и биологическую активность, снизить иммуногенность или другие побочные эффекты терапевтических белков и снизить затраты на производство промышленных ферментов. Среди всех испытанных методов гликоинженерия оказалась одним из самых многообещающих для будущих исследований.

    Гликоинженерия - это метод улучшения свойств белков путем изменения их гликозилирования (Goochee et al., 1991; Синклер и Эллиотт, 2005; Бек и Райхерт, 2012; Дикер и Штрассер, 2015). Гликозилирование белков относится к присоединению гликанов к белкам в форме ковалентных связей (рис. 1) (Spiro, 2002). Гликаны также можно назвать углеводами, сахарами, моносахаридами, олигосахаридами или полисахаридами. Гликозилирование - основная форма посттрансляционной модификации (ПТМ) белков. Гликозилирование может происходить на боковых цепях многих аминокислотных остатков белков множеством различных способов.Двумя наиболее распространенными способами являются присоединение гликанов к атомам азота (N) боковой цепи остатков Asn и к атомам кислорода (O) боковой цепи остатков Ser и Thr. В зависимости от атомов, с которыми связаны гликаны, эти два типа гликозилирования называются N-связанным гликозилированием и O-связанным гликозилированием соответственно. Помимо различных атомов боковой цепи в гликозидной связи, существует также много других различий между этими двумя типами гликозилирования. Например, в эукариотических клетках, где широко присутствует гликозилирование, первый остаток сахара, который непосредственно присоединен к Asn, обычно представляет собой β-связанный N-ацетилглюкозамин (β-GlcNAc), в то время как остатки на боковых цепях Ser и Thr включают множество различных структур, такие как β-GlcNAc, α-связанная N-ацетилгалактоза (α-GalNAc), α-связанная манноза (α-Man), α-связанная фукоза, β-связанная ксилоза, α- или β-связанная галактоза и глюкоза (Рисунок 1 ).

    Рисунок 1 . Гликозилирование белков. Двумя наиболее распространенными типами гликозилирования являются N- и O-связанное гликозилирование. Консенсусная последовательность для N-гликозилирования - это Asn-Xaa-Ser / Thr (где Xaa не является Pro). Консенсусной последовательности для O-гликозилирования не установлено. В эукариотических клетках первым сахарным остатком N-гликанов обычно является β-GlcNAc, тогда как первым остатком O-гликанов может быть β-GlcNAc, α-GalNAc, α-Man или другие моносахаридные единицы. R = H или Me, R 1 и R 2 = боковые цепи аминокислот.

    Белки с гликозилированием называются гликопротеинами. Многолетние исследования показали, что гликозилирование является важной PTM, которая играет важную роль в регулировании свойств белков (Rudd et al., 1994; Boyd et al., 1995; Van den Steen et al., 1998). Путем образования водородных связей или других нековалентных взаимодействий с аминокислотными остатками белков, к которым они присоединены, гликаны могут улучшить эффективность укладки и конформационную стабильность белков, предотвратить их аномальную агрегацию, повысить их растворимость в воде и снизить скорость их образования. термическая денатурация, протеолитическая инактивация и химическая деградация (Варки, 2017).Кроме того, гликаны могут также непосредственно участвовать во взаимодействии с другими макромолекулами, вирусами и клетками, тем самым приводя к изменению аффинности и специфичности связывания субстрата, а также к биологической активности гликопротеинов. По сравнению с другими типами PTM и аминокислотных мутаций, наибольшее преимущество гликозилирования состоит в том, что при правильном выборе сайтов гликозилирования и гликановых структур этот метод способен одновременно улучшать множество различных свойств белков.Такое преимущество вызвало большой интерес ученых к исследованию этого нового рубежа.

    С 1980-х годов ученые начали использовать гликозилтрансферазы и гликозидазы для добавления сахаров и удаления сахаров из олигосахаридных цепей белков, используя in vivo, (клеточные) генетические технологии и in vitro, ферментативные методы (Lee et al., 1989 ; Lairson et al., 2008; Bennett et al., 2012; Albesa-Jove et al., 2014; Janetzko, Walker, 2014; Moremen, Haltiwanger, 2019).Их усилия привели ко многим важным открытиям, а также к открытию и разработке многих терапевтических белков и ферментов с улучшенными свойствами и функциями. Но в целом количество успешно коммерциализированных ферментов и одобренных терапевтических белков, которые были разработаны с помощью белковой гликоинженерии, невелико, и, вероятно, наиболее известным из них является дарбэпоэтин альфа, новый терапевтический агент при почечной анемии (Elliott et al., 2003 г.). Возможное объяснение небольшого числа состоит в том, что не было достигнуто достаточного понимания взаимосвязи структура-функция гликозилирования белков, и не были полностью разработаны надежные научные теории для руководства усилиями по гликозилированию.Чтобы повысить эффективность гликопротеинов белков, ученым необходимо провести дополнительные исследования взаимосвязи между структурой и характеристиками гликопротеинов. Хотя разработка надежных руководящих принципов для прогнозирования результатов белковой гликоинженерии может занять много времени, в последние годы было получено все больше и больше обнадеживающих результатов. В этом обзоре мы суммируем и сравним некоторые репрезентативные результаты с целью дать общую картину этой области исследований.

    Этот обзор предназначен для того, чтобы дать краткое введение в область гликоинженерии белков. Мы коснемся лишь ограниченного числа примеров по каждому направлению исследований. Заинтересованные читатели могут обратиться к более подробным обзорам для получения подробной информации (Bailey, 1991; Wright and Morrison, 1997; Saxon and Bertozzi, 2001; Bretthauer, 2003; Sinclair and Elliott, 2005; Hamilton and Gerngross, 2007; Beck et al., 2008). ; Beck, Reichert, 2012; Beckham et al., 2012; Baker et al., 2013; Merritt et al., 2013; Дикер и Штрассер, 2015; Geisler et al., 2015; Грин и др., 2015; Buettner et al., 2018; Мимура и др., 2018; Монтеро-Моралес и Стейнкелльнер, 2018; Теджвани и др., 2018; Wang et al., 2018, 2019; Yates et al., 2018; Agatemor et al., 2019; Хардинг и Фельдман, 2019; Мастрангели и др., 2019). Помимо гликоинженерии с использованием встречающихся в природе гликанов и гликозидных связей для улучшения свойств белков, существует множество исследовательских работ, направленных на химический и ферментативный синтез гликанов, разработку вакцин и адъювантов на основе гликанов или использование неприродных гликанов и сайт-селективную конъюгацию. химии для достижения целей белковой гликоинженерии.Подробное обсуждение этих усилий выходит за рамки настоящего обзора. Необходимую информацию об этих исследованиях можно найти в отличных обзорных статьях Saxon and Bertozzi (2001), Sola et al. (2007), Gamblin et al. (2009), Wolfert and Boons (2013), Краснова и Вонг (2016), Wu et al. (2017), Sun et al. (2018), Вен и др. (2018), Губерман и Зеебергер (2019), Мормен и Халтивангер (2019) и Рахфельд и Уизерс (2020).

    Гликозилирование белков определяется сайтами гликозилирования и гликановыми структурами.Соответственно, гликозилирование белков осуществляется путем изменения двух параметров: сайта и структуры, а более конкретно, путем изменения количества и положения сайтов гликозилирования и / или путем изменения структуры гликанов (включая тип связи, длину цепи и состав). на отдельных сайтах гликозилирования. В зависимости от способа производства гликопротеинов гликопротеины белков можно условно разделить на две основные категории (Wang et al., 2019). В одной категории гликопротеины продуцируются клеточной экспрессией.В другой категории они получают путем химического синтеза, включая биохимический и органический синтез (Rich and Withers, 2009). Здесь мы сначала рассмотрим методы гликоинженерии, основанные на экспрессии клеток, а затем обсудим методы гликоинженерии, основанные на химическом синтезе.

    Гликоинжиниринг клеточного белка

    За последние 30 лет было разработано множество различных методов для создания клеток животных, растений, насекомых, дрожжей, бактерий и т. Д. Для экспрессии белков с желаемыми паттернами гликозилирования.Эти методы в основном используют технологии нокаута, нокдауна, нокаута, сверхэкспрессии, мутации или подавления малых молекул для изменения типа и концентрации гликозидаз и гликозилтрансфераз, доступных внутри этих клеток, тем самым изменяя паттерны гликозилирования заинтересованных белков, экспрессируемых в них. . Недавние достижения в инструментах редактирования генов, особенно в системе CRISPR / Cas9, сделали возможным более быструю и экономичную разработку гликоинженерии клеток (Chan et al., 2016; Chung et al., 2017; Мабаши-Асадзума и Джарвис, 2017; Янсинг и др., 2019; Кароттки и др., 2020). В настоящее время наиболее широко используемыми клетками для белковой гликоинженерии являются клетки млекопитающих.

    Гликоинженерия на основе клеток млекопитающих

    С 1980-х годов клетки млекопитающих, в основном клетки яичников китайского хомячка (СНО), используются для производства гликозилированных рекомбинантных терапевтических белков (Tejwani et al., 2018; Wang et al., 2018). По сравнению с линиями клеток человека, клетки CHO имеют тенденцию добавлять небольшое количество нечеловеческих гликанов α-галактозы (α-Gal) и N-гликолилнейраминовой кислоты (Neu5Gc) к рекомбинантным белкам (Hokke et al., 1990). Если их качество не контролируется должным образом, сконструированные гликопротеины, продуцируемые этой системой экспрессии, могут вызывать иммунный ответ. Несмотря на это незначительное ограничение, клетки CHO обладают множеством преимуществ. Во-первых, их можно культивировать в крупномасштабных биореакторах, и скорость их производства гликопротеинов намного выше, чем у человеческих клеток. Во-вторых, из-за естественных различий между видами клетки СНО с меньшей вероятностью передают патогены человека. Поскольку преимущества перевешивают недостатки, клетки СНО стали одной из наиболее широко используемых систем экспрессии клеток млекопитающих для продукции гликопротеинов.

    Одна из стратегий гликоинженерии белков, основанная на клетках СНО, заключается в изменении структуры гликанов на белках с помощью технологий нокаута генов для достижения цели улучшения их свойств. Репрезентативная работа в этом отношении заключается в усилении антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) иммуноглобулиновых (IgG) антител путем выключения α-1,6-фукозилтрансферазы (FUT8). ADCC - важный механизм терапии антителами. Антитела распознают поверхностные антигены клеток-мишеней и связываются с ними (например,g., раковые клетки) через антигенсвязывающие фрагменты (Fab) и взаимодействуют с рецепторами кристаллических фрагментов (Fc) (FcR) на эффекторных клетках (таких как естественные клетки-киллеры) через Fc-часть. После взаимодействия Fc с FcR иммунные эффекторные клетки активируются и секретируют цитотоксические молекулы для уничтожения клеток-мишеней. Этот процесс называется ADCC (рисунок 2). Усиление ADCC может быть достигнуто за счет увеличения аффинности связывания антител с рецепторами Fc, что, в свою очередь, может быть достигнуто путем модификации гликозилирования Fc-области IgG.

    Рисунок 2 . Антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC). ADCC запускается, когда Fab-домен антитела связывается с антигеном на клетке-мишени, а Fc-домен той же молекулы антитела связывается с FcR на эффекторной клетке.

    Высококонсервативные остатки Asn в положении 297 (N297) областей Fc IgG являются N-гликозилированными (Wright and Morrison, 1997; Beck et al., 2008; Reusch and Tejada, 2015; Mastrangeli et al., 2019). Предыдущие исследования показали, что остаток фукозы, присоединенный через α-1,6-связь к самому внутреннему N-GlcNAc N-гликанов по N297, является ключевым остатком для модуляции ADCC.Удаление ядра фукозы из гликанов IgG-Fc может значительно увеличить сродство связывания Fc с FcR, тем самым усиливая ADCC (Shields et al., 2002). FUT8 - единственный фермент, который катализирует перенос фукозы от GDP-фукозы к N-связанным олигосахаридам. Следовательно, отключение гена FUT8 в клетках CHO может быть многообещающим методом получения терапевтических антител IgG с усиленным ADCC (Yamane-Ohnuki et al., 2004). Эта концепция была подтверждена экспериментально. В репрезентативном исследовании Yamane-Ohnuk et al.успешно сгенерированы клеточных линий FUT8 - / - CHO / DG44 путем последовательной гомологичной рекомбинации. Результаты их экспрессии показали, что антитело к CD20 (IgG1), продуцируемое их клеточной линией, имело значительно повышенную аффинность связывания с человеческим рецептором FcγRIIIa, а ADCC этого антитела был увеличен примерно в 100 раз по сравнению с антителом, продуцируемым в нормальном CHO / Клетки DG44.

    Предыдущие исследования показали, что другие моносахариды N-гликанов, присоединенных к Asn297 IgG, также могут регулировать ADCC (например, бисектирующий GlcNAc связывает β-1,4 с маннозильным остатком в пентасахариде ядра, рис.3; Davies et al., 2001). Во время биосинтеза N-гликанов ключевым ферментом, который катализирует введение биссектрисы GlcNAc в N-гликаны, является β-1,4-N-ацетилглюкозаминилтрансфераза III (GnTIII). Основываясь на этих знаниях, Umana et al. (1999) сконструировали клеточную линию СНО, трансфицированную кДНК GnTIII. Способствуя сверхэкспрессии GnTIII, они смогли получить антитела IgG с увеличенным пополам GlcNAc. Их результаты показали, что ADCC продуцируемого антитела IgG намного выше, чем у антител, содержащих меньше биссектриков гликанов, что позволяет предположить, что деление GlcNAc пополам оказывает положительное влияние на ADCC.

    Рисунок 3 . Fc-гликозилированный иммуноглобулин G (IgG). Изображен N-связанный гликан сложного типа с фукозой сердцевины.

    Однако, хотя как удаление фукозы, так и добавление пополам GlcNAc усиливают ADCC антител, величина увеличения, вызываемого этими двумя различными типами модификаций, совершенно различается. Увеличение, вызванное модификацией N-гликанов путем деления GlcNAc пополам, обычно менее чем в 10 раз, что намного ниже, чем наблюдаемое при удалении фукозы.Кроме того, показатели успеха этих двух методов также различаются. Гликоинженерия, осуществляемая путем удаления остатков фукозы, имеет более высокую вероятность успеха, чем при добавлении пополам GlcNAc. Действительно, Ямане-Охнуки и др. (2004) утверждали, что деление GlcNAc пополам может не иметь эффекта на ADCC. Поэтому в настоящее время более широко используется первый метод.

    Высокая вариабельность и неоднозначная надежность результатов гликозилирования белков, основанных на разделении GlcNAc пополам, была связана с отсутствием ранее ясного и определенного понимания этого типа гликозилирования и того, как оно регулируется (Shinkawa et al., 2003). Эти гликоинженерные исследования были выполнены с использованием эмпирических данных. Без теоретической основы было мало что известно о том, как гликозилирование влияет на свойства белка и при каких обстоятельствах оно может улучшить свойства белка. Такой дизайн гликоинженерии не является очень научным и поэтому неизбежно приведет к противоречивым результатам. Чтобы изменить эту ситуацию, необходимо более глубокое и ясное понимание гликозилирования белков. Прекрасным примером, демонстрирующим эту точку зрения, является работа Феррары и др.(2006). Посредством своих исследований они обнаружили, что высокий уровень GlcNAc, деленный пополам, вызванный сверхэкспрессией GnTIII, ингибирует фукозилирование ядра, что приводит к увеличению доли N-гликанов без фукозы (Ferrara et al., 2006). Это открытие предполагает, что деление пополам GlcNAc может косвенно регулировать ADCC и, следовательно, его эффект не очень предсказуем.

    Повышение содержания других моносахаридов на N-гликанах в области Fc антител IgG, таких как предпоследний остаток Gal и концевые остатки N-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac / сиаловая кислота), также улучшает характеристики антител, включая усиление их ADCC, комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) и противовоспалительной активности (Tsuchiya et al., 1989; Раймонд и др., 2015). Подобно предыдущей неопределенной роли разделения GlcNAc пополам в ADCC, эффекты присутствия Gal и Neu5Ac на антитела IgG также не совсем ясны. Опять же, это в основном связано с отсутствием глубокого понимания гликозилирования белков. Причина, по которой трудно улучшить понимание гликозилирования, заключается в том, что не так много доступных инструментов для точного контроля или определения состава гликопротеинов. Например, при увеличении или уменьшении экспрессии одного или нескольких ферментов, участвующих в биосинтезе гликанов, трудно найти надежный аналитический инструмент, который позволил бы оценить, повлияет ли изменение их экспрессии на функции других гликозилтрансфераз и / или гликозидазы.Даже если это не так, присущая гетерогенность сахарных фрагментов затрудняет точное описание состава гликопротеинов, продуцируемых рекомбинантными клетками-хозяевами (Kodama et al., 1991; Higel et al., 2016). Гликозилирование не управляется матрицей, и гетерогенность гликопротеинов возникает из-за присутствия различных гликановых структур в одном сайте гликозилирования (микрогетерогенность) и различной степени занятости сайта гликозилирования (макрогетерогенность). Из-за гетерогенности гликопротеины обычно существуют в виде сложных смесей, которые могут состоять от нескольких десятков до более чем сотни различных гликоформ (Toll et al., 2006; Ян и др., 2016). Степень гетерогенности может варьироваться в зависимости от гликопротеинов и методов их получения. Исследователи из многих различных дисциплин приложили значительные усилия для разработки и оптимизации методов и инструментов для контроля и анализа гетерогенности рекомбинантных гликопротеинов и достигли обнадеживающих успехов. Например, разрабатывая вычислительные модели гликозилирования белков, исследователи теперь могут предоставить рекомендации по разработке оптимальных стратегий для получения целевого профиля гликозилирования с желаемыми свойствами (Umana and Bailey, 1997; Grainger and James, 2013; Spahn et al., 2016, 2017; Krambeck et al., 2017; Соколов и др., 2018; Лян и др., 2020). За счет улучшения хроматографического разделения и аналитических инструментов, таких как капиллярный электрофорез, высокоэффективная жидкостная хроматография и масс-спектрометрия, исследователи добились значительных успехов в определении идентичности и количества различных гликозилированных форм белка (гликоформ) (Domann et al., 2007; Zaia). , 2008; Артеменко и др., 2012; Campbell et al., 2014; Zhang et al., 2016). Ожидается, что дальнейший прогресс в этих областях еще больше расширит и углубит понимание роли различных моносахаридных единиц в регулировании свойств антител, что сделает результаты гликоинженерии на основе клеток более предсказуемыми в будущем.

    Помимо изменения структуры гликана в определенных сайтах гликозилирования, гликозилирование также может быть выполнено путем изменения количества сайтов гликозилирования. Наиболее представительным примером в этом отношении является гликоинженерия человеческого эритропоэтина (hEPO) (Egrie and Browne, 2001). Основное медицинское применение hEPO - это лечение анемии, особенно анемии, вызванной хронической болезнью киндни, лучевой терапией и химиотерапией рака. Проще говоря, цель гликозилирования hEPO - продлить период его полужизни in vivo за счет увеличения количества его сайтов N-связанного гликозилирования.Встречающийся в природе hEPO содержит три сайта N-гликозилирования и один сайт O-гликозилирования (рис. 4). Neu5Ac, расположенный в концевом положении N-связанных гликанов, важен для периода полужизни белков в кровотоке, поскольку он может помочь снизить вероятность того, что белок будет поглощен гепатоцитами в результате эндоцитоза, отфильтрован клубочками и разложен протеазами (Morell и др., 1971). Благодаря тщательному исследованию и анализу Elliott et al. (2004) обнаружили, что гораздо проще добавить новые сайты N-гликозилирования к hEPO, чем увеличивать количество O-связанных сайтов.Основная причина этого наблюдения заключается в том, что сайты N-гликозилирования определяются консенсусной последовательностью (или секвоном), Asn-Xaa-Thr / Ser, где Asn представляет собой сайт гликозилирования, а Xaa представляет собой любую природную аминокислоту, кроме Pro. Хотя не гарантируется, что остатки Asn во всех консенсусных последовательностях могут быть гликозилированы, вероятность того, что они несут N-гликаны, очень высока. В отличие от N-гликозилирования, они обнаружили, что O-гликозилирование, по-видимому, не контролируется контекстом первичной последовательности и не имеет четких согласованных последовательностей, и полагают, что оно может быть направлено вторичной или третичной структурой и происходит только в очень немногих сайтах. который может соответствовать его конформационным требованиям (Elliott et al., 1994). Руководствуясь этими эмпирическими данными, Elliott et al. решили ввести новые сайты N-гликозилирования в hEPO только посредством сайт-направленного мутагенеза. Когда последовательность ДНК, кодирующая мутантный hEPO, экспрессировалась в клетках CHO, к ее поверхности добавляли пять N-гликанов и один O-гликан. Эти два дополнительных N-гликана значительно увеличили содержание Neu5Ac в hEPO и, таким образом, помогли снизить скорость его выведения из кровотока и улучшить его клиническую эффективность.

    Рисунок 4 .Гликозилированный эритропоэтин человека (hEPO). Природный hEPO содержит четыре сайта гликозилирования, которые расположены в Asn24, Asn38, Asn83 и Ser126.

    В дополнение к методу гликоинженерии, регулирующему экспрессию и активность ферментов, участвующих в биосинтезе гликанов, и методу увеличения количества сайтов гликозилирования, другим широко используемым методом является метаболический гликозилирование, метод, который был разработан почти тридцать лет назад, где гликозилирование белков можно изменить, изменив концентрацию моносахаридов или нуклеотидных сахаров в питательной среде (Bailey, 1991; Gramer et al., 2011; Buettner et al., 2018; Agatemor et al., 2019). Типичным примером является исследование Gu и Wang (1998), в котором 20 мМ N-ацетиламиноманнозы (ManNAc) добавляли в культуральную среду клеток CHO. Они обнаружили, что добавка способна снизить долю не полностью сиалилированных N-гликанов в Asn97 интерферона-γ (IFN-γ) с 35 до 20% без какого-либо неблагоприятного воздействия на рост клеток и продукцию белка. В системах млекопитающих ManNAc является метаболическим предшественником биосинтеза Neu5Ac.Он превращается в Neu5Ac в цитозоле, после чего Neu5Ac проникает в ядро ​​и активируется с образованием CMP-Neu5Ac. Наконец, CMP-Neu5Ac транспортируется в аппарат Гольджи, где Neu5Ac переносится в олигосахаридную цепь. Таким образом, увеличение концентрации ManNAc приводит к повышенному уровню Neu5Ac, что, в свою очередь, приводит к увеличению периода полужизни гликопротеинов. Помимо ManNAc, широкий спектр предшественников метаболитов, ингибиторов гликозилтрансферазы, модуляторов pH, а также параметров клеточных культур (например,g., pH, температура) также были исследованы для гликоинженерии белков (Sha et al., 2016; Ehret et al., 2019). Гликоинженерные методы, основанные на метаболизме и регуляции экспрессии и активности ферментов, в принципе схожи, оба из которых достигают изменений в структурах гликанов, вмешиваясь в путь биосинтеза N-гликанов. Таким образом, можно предположить, что метод метаболической гликоинженерии также ограничен природой системы экспрессии клеток СНО. Гликоинженерные белки, полученные с помощью этого метода, также существуют в виде неразделимых гетерогенных смесей гликоформ.

    Помимо клеток СНО, существует множество других клеточных линий млекопитающих, которые использовались для гликоинженерии белков, причем наиболее частыми из них являются клетки миеломы мыши NS0 и SP2 / 0 (Lifely et al., 1995). Преимущества этих клеток для гликоинженерии очень похожи на преимущества клеток CHO, то есть они также относительно просты в использовании и могут давать высокий выход белков. Их недостатки также аналогичны недостаткам клеток CHO, то есть сконструированные гликопротеины, продуцируемые клетками, находятся в форме гетерогенных смесей и могут содержать следы нечеловеческих моносахаридов, таких как α-Gal и Neu5Gc и т. Д.

    Гликоинженерия на основе клеток не млекопитающих

    Ученые также выбрали множество различных типов клеток, не относящихся к млекопитающим, для белковой гликоинженерии, включая клетки растений, насекомых, дрожжей и бактерий. По сравнению с клетками млекопитающих, растительные клетки обладают рядом преимуществ, наиболее важным из которых является то, что гликопротеины, продуцируемые в растительных клетках, более гомогенны, чем гликопротеины, синтезируемые в клетках млекопитающих (Montero-Morales and Steinkellner, 2018). Причина этого в том, что клетки растений обычно производят только несколько N-гликанов, причем два из них, а именно GnGnXF и MMXF, составляют более 90% от общего количества (рис. 5) (Chen, 2016).Следовательно, растительные клетки могут генерировать гликопротеины с более определенными структурами N-гликанов. Высокая степень гомогенности лучше поможет установить подробный вклад гликанов в физико-химические и биологические свойства белков, и такая информация будет полезна для гликотехники белков. Другие преимущества растительных клеток в качестве хозяина-продуцента включают быструю продукцию гликопротеинов и высокую толерантность к манипуляциям с путями биосинтеза N-гликанов.Недостатком растительных клеток является то, что гликопротеины, продуцируемые такими клетками, обычно содержат специфичное для растений ядро ​​α-1,3-фукозы и β-1,2-ксилозы, которые отсутствуют у человека. Гликопротеины, украшенные такими моносахаридами, могут вызывать иммунные ответы. Преимущества и недостатки системы экспрессии насекомых аналогичны таковым у растительных клеток. Это также высокоэффективная система экспрессии и проста в использовании, но она может включать нечеловеческие гликановые структуры, включая фрагмент α-1,3-фукозы, в целевые гликопротеины (Geisler et al., 2015). Основное различие между этими двумя экспрессионными системами, не относящимися к млекопитающим, состоит в том, что они продуцируют разные гликановые структуры (рис. 5).

    Рисунок 5 . N-связанные гликаны на гликопротеинах, продуцируемые в различных системах экспрессии.

    Метилотрофные дрожжи Pichia pastoris также были разработаны для гликоинженерии белков (Cereghino and Cregg, 2000; Bretthauer, 2003; Choi et al., 2008). По сравнению с клетками млекопитающих дрожжи можно культивировать при более высокой плотности клеток, что делает производство гликопротеина более эффективным, а стоимость производства намного дешевле.Однако О-связанные гликаны в Pichia pastoris обычно представляют собой линейные цепи олигоманноз, а N-связанные гликаны относятся к типу высокоманнозы (рис. 5). Терапевтические гликопротеины, несущие такие гликановые структуры, могут легко выводиться из организма из-за отсутствия концевых остатков Neu5Ac. В последнее время бактерии также привлекли большой интерес к их потенциальному использованию для белковой гликоинженерии в качестве быстрой, простой и недорогой системы экспрессии (Baker et al., 2013; Merritt et al., 2013; Yates et al., 2018). Однако гликаны в бактериях также значительно отличаются от гликанов человека (рисунок 5) (Du et al., 2019; Harding and Feldman, 2019). Чтобы избежать риска иммуногенных реакций со стороны нечеловеческих гликанов, за последние двадцать лет были предприняты попытки нескольких подходов к гуманизации дрожжевых и бактериальных путей N-гликозилирования (Hamilton and Gerngross, 2007). Например, Гамильтон и др. (2006) сконструировали путь гликозилирования белка в Pichia pastoris , отключив четыре дрожжевых гена гликозилирования и введя 14 генов гетерологичного гликозилирования.Используя экспрессионную систему humanzied Pichia pastoris , они смогли продуцировать hEPO, содержащий преимущественно человеческие N-гликаны, которые имели более 90% терминального сиалирования. Однако, хотя сегодня существует множество вариантов систем, не относящихся к млекопитающим, доступных для белковой гликоинженерии, они не нашли широкого применения в производстве терапевтических гликопротеинов, в основном из-за сложности этих систем экспрессии.

    Клетки немлекопитающих также могут применяться для гликоинженерии промышленных ферментов.В отличие от терапевтических белков, где иммунный ответ вызывает беспокойство, промышленные ферменты не являются продуктами для прямого использования человеком, и поэтому нет необходимости гуманизировать пути гликозилирования в этих клетках. В настоящее время методы гликоинженерии промышленных ферментов в основном включают изменение структур гликанов промышленных ферментов путем переключения их систем экспрессии, оптимизации условий культивирования или изменения количества сайтов гликозилирования посредством аминокислотных мутаций. В этой области исследований одним из относительно наиболее изученных семейств промышленных ферментов является семейство целлюлаз (Beckham et al., 2012; Грин и др., 2015). Целлюлазы - это гликозидгидролазы (GH), которые могут разлагать целлюлозу в древесине, сельскохозяйственных остатках и твердых бытовых отходах на сахара с более короткой цепью, такие как целлодекстрин, целлобиозу и глюкозу, которые затем могут быть преобразованы в биоэтанол в процессе ферментации. В процессе производства биоэтанола решающую роль играет ферментативная активность целлюлазы. Чтобы улучшить эффективность целлюлазы, Adney et al. (2009) инактивировали сайт N-гликозилирования в положении 384 целлобиогидролазы семейства 7 Trichoderma reesei ( Tr Cel7A) путем мутации и экспрессировали полученный мутантный фермент в другом хозяине, Aspergillus niger var.Niger , грибок и один из наиболее распространенных видов рода Aspergillus . Сравнивая динамику гидролиза бактериальной целлюлозы для Tr Cel7A дикого типа и мутанта, они обнаружили, что удаление гликана по N384 привело к повышению активности фермента на 70% через 120 часов. Однако, хотя ферментной гликоинженерии в последние годы уделяется все больше и больше внимания, результаты гликоинженерии все еще неудовлетворительны.Чтобы быстрее получить лучшие результаты, необходимо более подробное исследование, чтобы ответить на некоторые фундаментальные вопросы, на которые нет ответа. Эти вопросы, по сути, те же, что и для терапевтических исследований гликозилирования белков: что, как и почему определенные паттерны гликозилирования могут улучшить работу ферментов.

    Гликоинженерия белков на основе химии

    За последние 40 лет был достигнут значительный прогресс во всех аспектах клеточной гликоинженерии белков, включая оптимизацию условий ферментации, генетическую модификацию хозяев, экспрессирующих гликопротеин, очистку гликопротеина, анализ состава и характеристику.Однако проблемы, ограничивающие широкое применение этого подхода в промышленности и медицине, все еще существуют. Как упоминалось выше, проблемы в основном связаны с неотделимой и непредсказуемой природой смесей гликоформ, продуцируемых разными клетками. Поскольку все еще сложно точно и эффективно количественно оценить гетерогенные смеси гликоформ, нетривиально получить окончательную и надежную информацию об изменениях свойств, вызванных гликозилированием белков. Чтобы решить эти проблемы, ученые исследовали различные технологии, позволяющие упростить сложность образцов гликопротеинов, например, те, которые связаны с использованием инженерии путей гликозилирования белков, и те, которые основаны на использовании биохимии и органической химии.Эти технологии ни в каком простом смысле не заменяют или исключают друг друга, а скорее дополняют и обогащают друг друга.

    По сравнению с клеточными технологиями, химия имеет преимущество в том, что она относительно более точна и гибка для производства гомогенных гликоформ белков, но имеет недостаток в том, что она более трудоемка и менее полезна в крупномасштабном производстве. Теоретически химия допускает мелкомасштабное приготовление гомогенных гликоформ с любыми гликанами или любыми аминокислотными последовательностями, которые могут удовлетворить требования структурного разнообразия и репрезентативности исследовательских образцов как для фундаментальных исследований, так и для исследований гликопротеинов белков.Однако, помимо вышеупомянутого недостатка, химия как инструмент в настоящее время все еще незрела: многие важные этапы синтеза гликопротеина не были оптимизированы, а наиболее важные исходные материалы коммерчески недоступны. Таким образом, для непрофессионалов все еще сложно использовать химию для выполнения гликопротеинов белков.

    Гликоинженерия на основе биохимии

    Гликоинженерия белков, основанная на биохимических методах, в основном достигается за счет использования биохимических реакций, катализируемых различными гликозидазами и гликозилтрансферазами (Rothman et al., 1989; Неманский и др., 1995; Hodoniczky et al., 2005). Гликозидазы катализируют расщепление гликозидных связей, в то время как гликозилтрансферазы катализируют противоположную реакцию, образование гликозидной связи, в основном с использованием сахарных нуклеотидов в качестве гликозильных доноров. Гликозидазы широко классифицируются как экзо- и эндогликозидазы. Экзогликозидазы последовательно удаляют моносахариды с невосстанавливающего конца гликанов. Эндогликозидазы способны расщеплять специфические гликозидные связи внутри гликановых цепей.

    В последние годы применение гликозидаз и гликозилтрансфераз для гликопротеинов, включая разработку технологии бесклеточного синтеза гликопротеинов, значительно продвинуло эту область вперед (Jaroentomeechai et al., 2018; Wen et al., 2018; Kightlinger et al. ., 2019; Moremen, Haltiwanger, 2019; Rahfeld and Withers, 2020). Важным аспектом в этом продвижении является то, что мы осознаем важность тонких вариаций в структурах гликанов для работы белков (Washburn et al., 2015). Типичным примером является изменение гликозидных связей между концевым остатком сиаловой кислоты и предпоследним остатком галактозы, Anthony et al . смог значительно улучшить терапевтическую эффективность внутривенного иммуноглобулина (ВВИГ) (Anthony et al., 2008). В качестве продукта крови ВВИГ используется для лечения аутоиммунных заболеваний, включая иммунную тромбоцитопению, ревматоидный артрит и системную красную волчанку. Как и многие другие гликозилированные антитела, его N-связанные гликаны в положении аминокислоты 297 имеют много разных структур, некоторые без концевого Nue5Ac, а некоторые с α-2,6-связанным или α-2,3-связанным Neu5Ac (Kaneko et al. ., 2006). В своей работе Anthony et al. (2008) обнаружили, что при лечении ВВИГ α-2,6-нейраминидазой противовоспалительная активность ВВИГ полностью утрачивается. При переваривании α-2,3-нейраминидазой его активность не изменилась. Это наблюдение позволило предположить, что противовоспалительная активность ВВИГ может напрямую коррелировать с присутствием α-2,6-Neu5Ac. Руководствуясь этой гипотезой, они сначала удалили остатки Neu5Ac из гликанов на сайте Asn297 фрагментов Fc, полученных из IVIG, с помощью α-2,3 / 6-нейраминидазы, а затем использовали β-1,4-галактозилтрансферазу и α-2, 6-сиалилтрансферазы для повышения их гомогенности и уровня α-2,6-сиалилирования (рис. 3).Биологические тесты подтвердили, что полученные фрагменты Fc обладали такой же противовоспалительной активностью при значительно сниженных дозах. Успех этих усилий по гликоинженерии продемонстрировал важность повышения уровня гомогенности гликопротеинов для повышения возможностей гликопротеинов.

    Хотя относительно гомогенные гликопротеины могут быть получены путем комбинированного использования гликозидаз и гликозилтрансфераз, это довольно сложный процесс, во многом из-за текущих ограничений гликозилтрансфераз и реакций, которые они катализируют.Гликозилтрансферазы обычно добавляют определенные моносахариды по одному к определенным субстратам и к определенным сайтам на этих субстратах. Кроме того, многие гликозилтрансферазы и доноры сахарных нуклеотидов либо дороги, либо коммерчески недоступны. Все эти факты делают не очень простым применение многоэтапных реакций, катализируемых гликозилтрансферазой, для генерации большого количества гомогенных гликоформ, несущих структурно близкородственные гликаны, для удовлетворения исследовательских потребностей белковой гликоинженерии.Чтобы преодолеть эти ограничения, необходимо заменить поэтапный ферментативный подход на высококонвергентный. Ключом к достижению конвергентного синтеза является поиск ферментов, которые могут катализировать присоединение олигосахаридов относительно неспецифично к различным субстратам. Чтобы удовлетворить этот спрос, был разработан новый класс ферментов. Их называют «гликозинтазами» (Mackenzie et al., 1998; Malet and Planas, 1998). Гликозинтазы обычно получают из гликозидаз в результате генетических мутаций.В присутствии активированных доноров олигосахаридов гликозинтазы могут переносить en bloc олигосахаридов на различные акцепторы гликопротеинов с высокими выходами (рис. 6).

    Рисунок 6 . Катализируемое гликозинтазой N-гликозилирование с использованием доноров оксазолина. R = H или Me, R 1 = боковые цепи аминокислот.

    Гликоинженерный метод, основанный на трансгликозилировании, катализируемом гликозинтазой, аналогичен методу, основанному на реакциях, катализируемых гликозилтрансферазой.Это также требует удаления большой части N-связанных гликанов из гликопротеинов гликозидазами до реакции трансгликозилирования. Этот метод был изобретен более двух десятилетий назад, и в наиболее часто используемом в настоящее время методе в качестве донорных субстратов используются олигосахаридные оксазолины (рис. 6; Wei et al., 2008; Wang et al., 2019). Разработка ферментов гликозинтазы помогла решить проблему структурного разнообразия гликоформ, которая в определенной степени необходима для исследований гликозинженерии.Например, Lin et al. (2015) с помощью ферментов этого типа смогли создать более десятка гомогенных глико-вариантов антител, то есть вариантов с разными паттернами гликозилирования. Сравнивая активность синтетических гликопродуктов, они обнаружили, что двухантенные N-гликаны сложного типа с двумя концевыми α-2,6-связанными остатками Neu5Ac представляются оптимальными структурами. Антитела, модифицированные такими гликанами, показали повышенную активность против рака, гриппа и воспаления.

    В дополнение к увеличению разнообразия гликоформ для исследований, метод на основе гликозинтазы также может применяться для достижения селективности сайта гликозилирования, то есть присоединения разных гликанов к разным сайтам гликозилирования.В качестве примера такого исследования Giddens et al. (2018) успешно получили несколько вариантов антител с различными N-гликанами в сайтах гликозилирования в их Fc- и Fab-областях путем комбинированного использования трех эндогликозидаз (Endo-S, Endo-S2 и Endo-F3), 1,6-фукозидазы. из Lactobacillus casei и мутантов эндогликозидазы. Они обнаружили, что антитела, содержащие сиалированные N-гликаны на Fab-фрагментах и ​​нефукозилированные на Fc-фрагментах, обладают повышенной способностью связывания с рецептором FcγRIIIa и значительно улучшают активность ADCC.

    Преимущество ферментативной гликоинженерии in vitro состоит в том, что, улучшая структурный контроль гликозилирования белков, он обеспечивает относительно легкий доступ к гомогенным гликоформам. С помощью таких исследовательских выборок можно вывести количественные взаимосвязи между структурой и функцией, которые помогут разработать новые исследования в области белковой гликоинженерии. Однако эффективность этого метода в настоящее время все еще ограничена из-за ограниченной коммерческой доступности олигосахаридных субстратов, ограниченного диапазона субстратов, которые могут переноситься ферментами гликозинтазы, и трудно контролируемой селективности сайта гликозилирования.Также сложно использовать этот метод в больших масштабах. Из-за этих ограничений разнообразие и количество сгенерированных образцов может быть недостаточно высоким для удовлетворения требований, и, таким образом, процесс исследования может быть медленным, а идентифицированные гликоформы могут быть не лучшим выбором для будущего использования. Кроме того, из-за различий в ферментах, участвующих в O-гликозилировании белка, в настоящее время все еще трудно ферментативно переносить олигосахариды en bloc в сайты O-гликозилирования.Но благодаря разработке полезного программного обеспечения, такого как ISOGlyP и NetOglyc, теперь можно прогнозировать сайты O-гликозилирования на основе особенностей последовательности и структуры белков (Hansen et al., 1998; Leung et al., 2014).

    Гликоинженерия на основе органической химии

    Конструирование О-связанного гликозилирования белков может быть достигнуто путем органического синтеза. Этот метод также может значительно расширить структурное разнообразие гликоформ. Эти преимущества в основном проистекают из более точного и гибкого характера органического синтеза.В отличие от многих других методов, органический синтез позволяет модифицировать гликопротеиновые структуры на атомном уровне. Теоретически это могло бы позволить ученым приготовить гликоформы, содержащие любое количество сайтов гликозилирования и любой тип гликановых структур, которые необходимы для исследований гликозилирования белков (Price et al., 2012; Chaffey et al., 2018).

    За последние два десятилетия, с развитием синтетических методов получения гликанов и белков, был также разработан полный химический синтез гликопротеинов (Fernandez-Tejada et al., 2015). Текущая стратегия синтеза гликопротеинов основана на естественном химическом лигировании / безметалловой десульфуризации (NCL / MFD) для соединения синтетических пептидов и гликопептидных фрагментов вместе. После этого полученные длинные гликопептидные цепи можно свернуть in vitro с образованием биологически активных гликопротеинов. Пептиды для синтеза гликопротеинов могут быть получены из коммерчески доступных защищенных аминокислот путем твердофазного пептидного синтеза (SPPS). N-гликопептиды можно синтезировать путем конденсации гликозиламинов с незащищенными по боковым цепям аспарагиновыми кислотами в частично защищенных пептидах.О-связанные гликопептиды могут быть получены путем включения строительных блоков О-гликозилированных аминокислот во время SPPS.

    Среди проведенных исследований наиболее представительным является случай химической гликоинженерии hEPO. В своем исследовании Wang et al. (2013) впервые применили технологию NCL / MFD для сборки последовательности гликозилированного hEPO из трех N-гликопептидов, одного O-гликопептида и одного пептида, которая затем была свернута в окислительно-восстановительную систему цистеин-цистин для получения окончательной трехмерной структуры. hEPO.Полученный гликоформ обладает ожидаемой биологической активностью (рис. 4). Эта работа впервые предоставила достаточные экспериментальные доказательства возможности белковой гликоинженерии на основе стратегии химического синтеза и заложила прочную основу для дальнейшего развития в этой области исследований.

    Используя химические подходы, две исследовательские группы смогли разработать новые рекомендации по N- и O-связанной гликоинженерии белков (Chaffey et al., 2018). В своей работе Price et al.(2012) представили теоретический принцип, которым руководствуются при разработке N-гликоинженерии белков, в котором говорится, что «включение усиленных ароматических секвонов в соответствующие типы обратного поворота в белках должно усилить хорошо известные фармакокинетические преимущества стабилизации на основе N-гликозилирования за счет снижения популяция чувствительных к протеазам развернутых состояний и склонных к агрегации неправильно свернутых состояний ». Усиленный ароматический секвон обычно представляет собой последовательность из пяти или шести остатков, которая содержит ароматическую аминокислоту, расположенную в двух или трех местах от N-конца консенсусной последовательности N-связанного гликозилирования (Asn-Xaa-Thr / Ser). .Последовательность из пяти остатков образует β-поворот типа I, а последовательность из шести остатков образует β-поворот типа II. Этот принцип был подтвержден в практических приложениях, таких как N-гликоинженерия богатого β-листами домена WW из 34 остатков из человеческого белка Pin1 (Pin WW). Путем замены петли 1 Pin WW на ароматический секвон с усилением из пяти остатков, Phe16-Ala18-Asn19-Gly20-Thr21, и гликозилирования Asn19 с помощью N-GlcNAc, Price et al. (2011) смогли значительно повысить его температуру плавления.

    Систематически изучая влияние O-связанных гликанов на свойства модуля связывания углеводов семейства 1, Patrick et al.установили руководство для белковой O-гликоинженерии, в котором говорилось, что «O-связанные гликоформы с лучшими общими свойствами могут быть созданы путем совместного изменения гликановых структур и соседних аминокислот в неструктурированных областях, которые важны для биологической функции и / или подвержены протеолитическому расщеплению, и другие нежелательные реакции разложения »(Chaffey et al., 2018). Справедливость этого руководства была подтверждена гликоинженерным исследованием терапевтического белка, человеческого инсулина.В этом исследовании они продемонстрировали, что О-маннозилирование B-цепи инсулина Thr27 снижает его чувствительность к протеазам и самоассоциацию (Guan et al., 2018).

    Однако, хотя гликоинженерия белков, основанная на органической химии, имеет некоторые преимущества, она также имеет и большой недостаток, то есть органический синтез гликопротеинов как новая технология не оптимизирован, и в настоящее время ее могут использовать только опытные исследователи. Чтобы сделать этот гликоинженерный подход широко принятым и использованным, необходимо приложить больше усилий для улучшения синтеза олигосахаридов и гликопептидов и эффективности лигирования пептидных / гликопептидных фрагментов.Возможно, что еще более важно, необходимо ускорить процесс коммерциализации гликановых строительных блоков, олигосахаридов, гликопептидов и даже синтетических гликоформ, потому что легкий доступ к этим веществам обычно может помочь ученым получить и сохранить интерес к области исследований.

    Выводы и перспективы

    Гликоинженерия белков как важный способ повышения эффективности терапевтических белков и промышленных ферментов вызвала значительный интерес в последние несколько десятилетий (Неустроев и др., 1993; Elliott et al., 2003). Однако из-за отсутствия надежного руководства эта технология все еще находится в зачаточном состоянии, и степень ее признания в научном сообществе невысока. В настоящее время, поскольку основанные на биологии методы относительно легко реализовать, некоторые из них, особенно те, которые включают манипуляции с путем N-гликозилирования белка, чаще используются в исследованиях белковой инженерии. Хотя такие методы дают некоторые результаты быстрее, результаты могут иметь некоторую неопределенность из-за неоднородности и низкой чистоты исследовательских образцов (Mimura et al., 2018). Методы, основанные на химии, особенно органический синтез, могут помочь преодолеть некоторые проблемы неопределенности, потому что они могут производить структурно определенные гомогенные гликоформы. Но у органического синтеза есть своя слабость. Его сложно использовать, он сложен, дорог и требует много времени.

    Чтобы решить данную проблему, эти различные методы должны быть лучше объединены, чтобы повысить практическую применимость и вероятность успеха белковой гликоинженерии. Возможная стратегия комбинирования следующая: органический и / или ферментативный синтез используется для глубокого понимания взаимосвязей структура-свойство репрезентативных модельных гликопротеинов, которые имеют относительно небольшие размеры и простые структуры.Теоретические прогнозы, основанные на высокоуровневом понимании гликозилирования белков, могут затем использоваться для руководства усилиями по гликозилированию белков (Umana and Bailey, 1997; Grainger and James, 2013; Spahn et al., 2016, 2017; Krambeck et al., 2017; Соколов и др., 2018; Liang et al., 2020). Наконец, клеточные методы могут использоваться для более быстрого получения сконструированных гликоформ в больших масштабах. Предыдущие исследования показали осуществимость этой стратегии. Ожидается, что такая стратегия, когда она будет полностью внедрена, будет в значительной степени способствовать развитию белковой гликоинженерии в будущем.

    Авторские взносы

    BM, XG, YL, SS, JL и ZT написали статью. Все авторы одобрили окончательную версию рукописи.

    Финансирование

    Программа обучения Основного плана исследований Национального фонда естественных наук Китая (грант №

    120), Общая программа Национального фонда естественных наук Китая (грант № 31872720), Национальный крупный научно-технический специальный проект Китай (гранты № 2018ZX09711001-005 и 2018ZX09711001-013), Национальная программа ключевых исследований и разработок Китая (грант №2018YFE0111400) и Программе грантов на исследовательские проекты NIH (R01 EB025892).

    Конфликт интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Благодарности

    Мы хотели бы поблагодарить Национальный фонд естественных наук Китая, Министерство науки технологий Китая, Государственную ключевую лабораторию биоактивных веществ и функций природных лекарств, Институт Материа Медика, Китайскую академию медицинских наук и Пекин. Union Medical College и Национальный институт здравоохранения США за финансирование.

    Список литературы

    Adney, W. S., Jeoh, T., Beckham, G. T., Chou, Y., Baker, J. O., Michener, W., et al. (2009). Исследование роли N-связанных гликанов в стабильности и активности целлобиогидролаз грибов с помощью мутационного анализа. Целлюлоза 16, 699–709. DOI: 10.1007 / s10570-009-9305-1

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Агатемор, К., Бюттнер, М. Дж., Арисс, Р., Мутиа, К., Саюи, К. Т., и Ярема, К. Дж. (2019). Использование метаболической гликоинженерии для улучшения здравоохранения. Nat. Ред. Chem . 3, 605–620. DOI: 10.1038 / s41570-019-0126-y

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Албеса-Джов, Д., Гиганти, Д., Джексон, М., Альзари, П. М., и Герен, М. Э. (2014). Структурно-функциональные отношения мембран-ассоциированных гликозилтрансфераз GT-B. Гликобиология 24, 108–124. DOI: 10.1093 / glycob / cwt101

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Энтони, Р. М., Ниммерьян, Ф., Эшлайн, Д. Дж., Райнхольд, В. Н., Полсон, Дж. К., и Раветч, Дж. В. (2008). Резюме противовоспалительной активности ВВИГ с рекомбинантным Fc IgG. Наука 320, 373–376. DOI: 10.1126 / science.1154315

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бейкер, Дж. Л., Челик, Э., и ДеЛиса, М. П. (2013). Расширение набора инструментов гликоинженерии: рост бактериального N-связанного гликозилирования белков. Trends Biotechnol . 31, 313–323. DOI: 10.1016 / j.tibtech.2013.03.003

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Beck, A., Wagner-Rousset, E., Bussat, M. C., Lokteff, M., Klinguer-Hamour, C., Haeuw, J. F., et al. (2008). Тенденции гликозилирования, гликоанализа и гликоинженерии терапевтических антител и Fc-слитых белков. Curr. Pharm. Биотехнология . 9, 482–501. DOI: 10.2174 / 1388786786411

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бекхэм, Г.Т., Дай, З., Мэтьюз, Дж. Ф., Момани, М., Пейн, К. М., Адни, В. С. и др. (2012). Использование гликозилирования для повышения активности целлюлазы. Curr. Opin. Биотехнология . 23, 338–345. DOI: 10.1016 / j.copbio.2011.11.030

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Беннетт, Э.П., Мандель, У., Клаузен, Х., Геркен, Т.А., Фриц, Т.А., и Табак, Л.А. (2012). Контроль O-гликозилирования муцинового типа: классификация полипептидного семейства генов GalNAc-трансферазы. Гликобиология 22, 736–756. DOI: 10,1093 / гликоб / cwr182

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бойд П. Н., Лайнс А. С. и Патель А. К. (1995). Влияние удаления сиаловой кислоты, галактозы и общих углеводов на функциональную активность Campath-1H. Мол. Иммунол . 32, 1311–1318. DOI: 10.1016 / 0161-5890 (95) 00118-2

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Кэмпбелл, М. П., Ranzinger, R., Lutteke, T., Mariethoz, J., Hayes, C.A., Zhang, J., et al. (2014). Наборы инструментов для стандартизированного и систематического изучения гликанов. BMC Bioinformatics 15 (Приложение 1), S9. DOI: 10.1186 / 1471-2105-15-S1-S9

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Серегино, Дж. Л., и Крегг, Дж. М. (2000). Гетерологичная экспрессия белка в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris. FEMS Microbiol. Ред. . 24, 45–66. DOI: 10.1111 / j.1574-6976.2000.tb00532.x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Чаффи, П. К., Гуань, X., Ли, Ю. и Тан, З. (2018). Использование химического синтеза для изучения и применения гликозилирования белков. Биохимия 57, 413–428. DOI: 10.1021 / acs.biochem.7b01055

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Чан, К. Ф., Шахрил, В., Ван, К., Тео, Г., Хаяти, Н., Тай, С. Дж. И др. (2016). Инактивация гена переносчика GDP-фукозы (Slc35c1) в клетках CHO с помощью ZFN, TALEN и CRISPR-Cas9 для продукции антител, свободных от фукозы. Biotechnol. J . 11, 399–414. DOI: 10.1002 / biot.201500331

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Chen, Q. (2016). Гликоинженерия растений дает гликопротеины с полисиалированием и другие определенные N-гликоформы. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 113, 9404–9406. DOI: 10.1073 / pnas.1610803113

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Чой, Б. К., актер, Дж. К., Риос, С., д'Анжу, М., Стадхейм, Т.А., Уорбертон С. и др. (2008). Рекомбинантный человеческий лактоферрин, экспрессированный в гликоинженерном Pichia pastoris : влияние концевой N-ацетилнейраминовой кислоты на вторичный гуморальный иммунный ответ in vitro. Glycoconj. J . 25, 581–593. DOI: 10.1007 / s10719-008-9123-y

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Chung, C.Y., Wang, Q., Yang, S., Yin, B., Zhang, H., and Betenbaugh, M. (2017). Интегрированное редактирование генома и белков заменяет сиалирование альфа-2,6 сиаловой кислотой на альфа-2,3 на рекомбинантных антителах из СНО. Biotechnol. J . 12: 1600502. DOI: 10.1002 / biot.201600502

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Дэвис, Дж., Цзян, Л., Пан, Л. З., Лабарр, М. Дж., Андерсон, Д., и Рефф, М. (2001). Экспрессия GnTIII в рекомбинантной клеточной линии, продуцирующей анти-CD20 CHO: экспрессия антител с измененными гликоформами приводит к увеличению ADCC за счет более высокого сродства к FC гамма RIII. Biotechnol. Bioeng . 74, 288–294. DOI: 10.1002 / бит.1119

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Дикер, М., и Штрассер, Р. (2015). Использование гликоинженерии для производства терапевтических белков. Мнение эксперта. Биол. Ther . 15, 1501–1516. DOI: 10.1517 / 14712598.2015.1069271

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Доманн П. Дж., Пардос-Пардос А. К., Фернандес Д. Л., Спенсер Д. И., Рэдклифф К. М., Ройл Л. и др. (2007). Подходы гликопрофилирования на основе разделения с использованием флуоресцентных меток. Proteomics 7 (Suppl. 1), 70–76. DOI: 10.1002 / pmic.200700640

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ду, Т., Буэнбразо, Н., Келл, Л., Рахмани, С., Сим, Л., Уизерс, С. Г. и др. (2019). Платформа бактериальной экспрессии для производства терапевтических белков, содержащих человеческие O-связанные гликаны. Cell Chem. Биол . 26, 203–212. DOI: 10.1016 / j.chembiol.2018.10.017

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Эрет, Дж., Циммерманн, М., Эйххорн, Т., и Циммер, А. (2019). Влияние добавок сред для культивирования клеток на гликозилирование IgG, продуцируемых в клетках яичников китайского хомячка. Biotechnol. Bioeng . 116, 816–830. DOI: 10.1002 / бит. 26904

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Эллиотт С., Бартли Т., Делорм Э., Дерби П., Хант Р., Лоренцини Т. и др. (1994). Структурные требования для добавления O-связанного углевода к рекомбинантному эритропоэтину. Биохимия 33, 11237–11245. DOI: 10.1021 / bi00203a020

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Эллиотт, С., Чанг, Д., Делорм, Э., Эрис, Т., и Лоренцини, Т. (2004). Структурные требования для дополнительного N-связанного углевода в рекомбинантном человеческом эритропоэтине. J. Biol. Chem . 279, 16854–16862. DOI: 10.1074 / jbc.M311095200

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Эллиотт, С., Лоренцини, Т., Ашер, С., Аоки, К., Бранков, Д., Бак, Л. и др. (2003). Повышение активности терапевтического белка in vivo посредством гликоинженерии. Nat.Биотехнология . 21, 414–421. DOI: 10.1038 / nbt799

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Фернандес-Техада, А., Брейлсфорд, Дж., Чжан, К., Ши, Дж. Х., Мур, М. А., и Данишефски, С. Дж. (2015). Полный синтез гликозилированных белков. Верх. Curr. Chem . 362, 1–26. DOI: 10.1007 / 128_2014_622

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ferrara, C., Brünker, P., Suter, T., Moser, S., Püntener, U., и Уманья, П. (2006). Модуляция терапевтических эффекторных функций антител с помощью инженерии гликозилирования: влияние домена локализации фермента Гольджи и совместная экспрессия гетерологичной бета1, 4-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III и альфа-маннозидазы Гольджи II. Biotechnol. Bioeng . 93, 851–861. DOI: 10.1002 / bit.20777

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Гейслер К., Мабаши-Асадзума Х. и Джарвис Д. Л. (2015). Обзор и история гликоинженерии в системах экспрессии насекомых. Methods Mol. Биол . 1321, 131–152. DOI: 10.1007 / 978-1-4939-2760-9_10

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Гидденс, Дж. П., Ломино, Дж. В., Дилилло, Д. Дж., Раветч, Дж. В. и Ван, Л. X. (2018). Сайт-селективная химико-ферментная гликоинженерия Fab и Fc гликанов терапевтического антитела. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 115, 12023–12027. DOI: 10.1073 / pnas.1812833115

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Гучи, К.Ф., Грамер М. Дж., Андерсен Д. К., Бар Дж. Б. и Расмуссен Дж. Р. (1991). Олигосахариды гликопротеинов: факторы биопроцесса, влияющие на структуру олигосахаридов и их влияние на свойства гликопротеинов. Биотехнология 9, 1347–1355. DOI: 10.1038 / nbt1291-1347

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Грейнджер, Р. К., и Джеймс, Д. К. (2013). Специфическое прогнозирование линии клеток СНО и контроль N-гликозилирования рекомбинантных моноклональных антител. Biotechnol. Bioeng . 110, 2970–2983. DOI: 10.1002 / бит.24959

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Грамер М. Дж., Экблад Дж. Дж., Донахью Р., Браун Дж., Шульц К., Викерман К. и др. (2011). Модуляция галактозилирования антител путем введения уридина, хлорида марганца и галактозы. Biotechnol. Bioeng . 108, 1591–1602. DOI: 10.1002 / бит. 23075

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Грин, Э.Р., Химмель, М. Э., Бекхэм, Г. Т., и Тан, З. (2015). Гликозилирование целлюлаз: разработка лучших ферментов для биотоплива. Adv. Углеводы. Chem. Биохим . 72, 63–112. DOI: 10.1016 / bs.accb.2015.08.001

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Гу, X., и Ван, Д. И. (1998). Улучшение сиалирования гамма-интерферона в культуре клеток яичников китайского хомячка путем кормления N-ацетилманнозамином. Биотехнология Биоенг . 58, 642–648. DOI: 10.1002 / (SICI) 1097-0290 (19980620) 58: 6 <642 :: AID-BIT10> 3.0.CO; 2-9

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Гуань, X., Чаффи, П.К., Вэй, X., Гулбрансон, Д.Р., Руан, Ю., Ван, X., и др. (2018). Химически точная гликоинженерия улучшает человеческий инсулин. ACS Chem. Биол . 13, 73–81. DOI: 10.1021 / acschembio.7b00794

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Гамильтон, С. Р., Дэвидсон, Р. К., Сетураман, Н., Nett, J.H., Jiang, Y., Rios, S., et al. (2006). Гуманизация дрожжей для производства сложных концевых сиалилированных гликопротеинов. Наука 313, 1441–1443. DOI: 10.1126 / science.1130256

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Гамильтон, С. Р., Гернгросс, Т. У. (2007). Инженерия гликозилирования в дрожжах: появление полностью гуманизированных дрожжей. Curr. Opin. Биотехнология . 18, 387–392. DOI: 10.1016 / j.copbio.2007.09.001

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Хансен, Дж.Э., Лунд, О., Толструп, Н., Гули, А. А., Уильямс, К. Л., и Брунак, С. (1998). NetOglyc: прогнозирование сайтов O-гликозилирования муцинового типа на основе контекста последовательности и доступности поверхности. Glycoconj. J . 15, 115–130. DOI: 10.1023 / A: 1006960004440

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Хигель, Ф., Зайдл, А., Зоргель, Ф., и Фрисс, В. (2016). Гетерогенность N-гликозилирования и влияние на структуру, функцию и фармакокинетику моноклональных антител и слитых белков Fc. Eur. J. Pharm. Биофарм . 100, 94–100. DOI: 10.1016 / j.ejpb.2016.01.005

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Hodoniczky, J., Zheng, Y.Z., and James, D.C. (2005). Контроль эффекторных функций рекомбинантных моноклональных антител путем ремоделирования Fc N-гликана in vitro . Biotechnol. Прог . 21, 1644–1652. DOI: 10.1021 / bp050228w

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Хокке, К.Х., Бергверфф, А.А., ван Дедем, Дж. У., ван Оострум, Дж., Камерлинг, Дж. П., и Флигентхарт, Дж. Ф. (1990). Сиалированные углеводные цепи рекомбинантных гликопротеинов человека, экспрессируемые в клетках яичников китайского хомячка, содержат следы N-гликолилнейраминовой кислоты. FEBS Lett . 275, 9–14. DOI: 10.1016 / 0014-5793 (90) 81427-P

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Янецко, Дж., И Уокер, С. (2014). Создание сладкой модификации: структура и функция трансферазы O-GlcNAc. J. Biol. Chem . 289, 34424–34432. DOI: 10.1074 / jbc.R114.604405

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Янсинг, Дж., Сак, М., Августин, С. М., Фишер, Р., и Бортеси, Л. (2019). CRISPR / Cas9-опосредованный нокаут шести генов гликозилтрансфераз в Nicotiana benthamiana для продукции рекомбинантных белков, лишенных бета-1,2-ксилозы и коровой альфа-1,3-фукозы. Plant Biotechnol. J . 17, 350–361. DOI: 10.1111 / PBI.12981

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Jaroentomeechai, T., Stark, J.C., Natarajan, A., Glasscock, C.J., Yates, L.E., Hsu, K.J., et al. (2018). Биосинтез гликопротеина в одном горшке с использованием внеклеточной системы транскрипции-трансляции, обогащенной аппаратом гликозилирования. Nat. Коммуна . 9: 2686. DOI: 10.1038 / s41467-018-05620-8

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Канеко, Ю., Ниммерьян, Ф., и Раветч, Дж.В. (2006). Противовоспалительная активность иммуноглобулина G в результате сиалирования Fc. Наука 313, 670–673. DOI: 10.1126 / science.1129594

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Karottki, K. J. C., Hefzi, H., Xiong, K., Shamie, I., Hansen, A. H., Li, S., Kildegaard, H. F., et al. (2020). Пробуждение спящих гликозилтрансфераз в клетках CHO с помощью CRISPRa. Biotechnol. Bioeng . 117, 593–598. DOI: 10.1002 / бит. 27199

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Kightlinger, W., Дункер, К. Э., Рамеш, А., Темз, А. Х., Натараджан, А., Старк, Дж. К. и др. (2019). Платформа бесклеточного биосинтеза для модульного построения путей гликозилирования белков. Nat. Коммуна . 10: 5404. DOI: 10.1038 / s41467-019-12024-9

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Кодама, С., Эндо, Т., Цуруока, Н., Цудзимото, М., и Кобата, А. (1991). Углеводные структуры интерлейкина 5 человека, экспрессируемые в клетках яичников китайского хомячка. Дж.Биохим . 110, 693–701. DOI: 10.1093 / oxfordjournals.jbchem.a123643

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Крамбек, Ф. Дж., Беннун, С. В., Андерсен, М. Р. и Бетенбо, М. Дж. (2017). Модельный анализ N-гликозилирования в клетках яичников китайского хомячка. PLoS ONE 12: e0175376. DOI: 10.1371 / journal.pone.0175376

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Краснова, Л., Вонг, К. Х. (2016).Понимание химии и биологии гликозилирования с синтезом гликанов. Annu. Ред. Biochem . 85, 599–630. DOI: 10.1146 / annurev-biochem-060614-034420

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Лэрсон, Л. Л., Хенриссат, Б., Дэвис, Дж. Дж., И Уизерс, С. Г. (2008). Гликозилтрансферазы: структуры, функции и механизмы. Annu. Ред. Biochem . 77, 521–555. DOI: 10.1146 / annurev.biochem.76.061005.0

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ли, Э.У., Рот Дж. И Полсон Дж. К. (1989). Изменение концевых последовательностей гликозилирования на N-связанных олигосахаридах клеток яичника китайского хомячка путем экспрессии бета-галактозид альфа 2,6-сиалилтрансферазы. J. Biol. Chem . 264, 13848–13855.

    PubMed Аннотация | Google Scholar

    Леунг, М.-Й., Карденас, Г.А., Алмейда, И.С., и Геркен, Т.А. (2014). Прогнозирование специфического для изоформ O-гликозилирования (ISOGlyP) Версия 1.2.

    PubMed Аннотация | Google Scholar

    Лян, К., Chiang, A. W. T., Hansen, A. H., Arnsdorf, J., Schoffelen, S., Sorrentino, J. T., et al. (2020). Марковская модель гликозилирования проясняет изоферментную специфичность и гликозилтрансферазные взаимодействия для гликоинженерии. Curr. Res. Биотехнология . 2, 22–36. DOI: 10.1016 / j.crbiot.2020.01.001

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Lifely, M. R., Hale, C., Boyce, S., Keen, M. J., and Phillips, J. (1995). Гликозилирование и биологическая активность CAMPATH-1H экспрессируется в разных клеточных линиях и выращивается в разных условиях культивирования. Гликобиология 5, 813–822. DOI: 10,1093 / гликоб / 5.8.813

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Lin, C. W., Tsai, M. H., Li, S. T., Tsai, T. I., Chu, K. C., Liu, Y. C., et al. (2015). Общая структура гликанов иммуноглобулина G для усиления эффекторных функций. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 112, 10611–10616. DOI: 10.1073 / pnas.1513456112

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Мабаши-Асадзума, Х., и Джарвис, Д. Л. (2017). Векторы CRISPR-Cas9 для редактирования генома и инженерии хозяина в системе бакуловирус-клетка насекомых. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 114, 9068–9073. DOI: 10.1073 / pnas.1705836114

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Маккензи, Л. Ф., Ван, К. П., Уоррен, Р. А. Дж., И Уизерс, С. Г. (1998). Гликозинтазы: мутантные гликозидазы для синтеза олигосахаридов. J. Am. Chem. Soc . 120, 5583–5584. DOI: 10.1021 / ja980833d

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Malet, C., и Planas, A. (1998). От бета-глюканазы к бета-глюкансинтазе: перенос гликозила на альфа-гликозилфториды, катализируемый мутантной эндоглюканазой, лишенной своего каталитического нуклеофила. FEBS Lett . 440, 208–212. DOI: 10.1016 / S0014-5793 (98) 01448-3

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Мастранджели, Р., Палински, В., и Бьерау, Х. (2019). Гликоинженерные антитела: к новому поколению иммунотерапевтических средств. Гликобиология 29, 199–210.DOI: 10.1093 / glycob / cwy092

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Мерритт, Дж. Х., Оллис, А. А., Фишер, А. К., и Делиса, М. П. (2013). Созданные гликаны: инженерные бактерии для биосинтеза сложных гликанов и гликоконъюгатов. Biotechnol. Bioeng . 110, 1550–1564. DOI: 10.1002 / бит.24885

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Мимура, Ю., Катох, Т., Салдова, Р., О'Флаэрти, Р., Изуми, Т., Мимура-Кимура, Ю. и др. (2018). Инженерия гликозилирования терапевтических антител IgG: проблемы безопасности, функциональности и эффективности. Protein Cell 9, 47–62. DOI: 10.1007 / s13238-017-0433-3

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Морелл А. Г., Грегориадис Г., Шейнберг И. Х., Хикман Дж. И Эшвелл Г. (1971). Роль сиаловой кислоты в определении выживания гликопротеинов в кровообращении. J. Biol. Chem .246, 1461–1467.

    PubMed Аннотация | Google Scholar

    Моремен, К. В., Халтивангер, Р. С. (2019). Новые структурные сведения о гликозилтрансферазном синтезе гликанов. Nat. Chem. Биол . 15, 853–864. DOI: 10.1038 / s41589-019-0350-2

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Nemansky, M., de Leeuw, R., Wijnands, R.A., and van den Eijnden, D.H. (1995). Ферментное ремоделирование N- и O-связанных углеводных цепей хорионического гонадотропина человека.Влияние на биологическую активность и связывание рецепторов. Eur. J. Biochem . 227, 880–888. DOI: 10.1111 / j.1432-1033.1995.tb20214.x

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Неустроев К. Н., Голубев А. М., Фирсов Л. М., Ибатуллин Ф. М., Протасевич И. И., Макаров А. А. (1993). Влияние модификации углеводного компонента на свойства глюкоамилазы. FEBS Lett . 316, 157–160. DOI: 10.1016 / 0014-5793 (93) 81206-F

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Овчарек, Б., Герсберг, А., Гнатушко-Конка, К. (2019). Краткое напоминание о системах производства и восстановления рекомбинантных белковых биофармацевтических препаратов на основе хроматографии. Biomed. Res. Инт . 2019: 4216060. DOI: 10.1155 / 2019/4216060

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Price, J. L., Culyba, E. K., Chen, W., Murray, A. N., Hanson, S. R., Wong, C.H., et al. (2012). N-гликозилирование усиленных ароматических секвонов для повышения стабильности гликопротеинов. Биополимеры 98, 195–211. DOI: 10.1002 / bip.22030

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Прайс, Дж. Л., Пауэрс, Д. Л., Пауэрс, Э. Т., и Келли, Дж. У. (2011). Гликозилирование усиленного ароматического секвона аналогичным образом стабилизируется в трех различных контекстах обратного поворота. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 108, 14127–14132. DOI: 10.1073 / pnas.1105880108

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Puetz, J., и Вурм, Ф. М. (2019). Рекомбинантные белки для промышленных и фармацевтических целей: обзор процесса и цен. Процессы 7: 476. DOI: 10.3390 / pr7080476

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Раймонд К., Роботэм А., Спирман М., Батлер М., Келли Дж. И Дурошер Ю. (2015). Продукция α2,6-сиалированного IgG1 в клетках СНО. MAbs 7, 571–583. DOI: 10.1080 / 19420862.2015.1029215

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ротман, Р.Дж., Перуссия, Б., Херлин, Д., и Уоррен, Л. (1989). Антителозависимая цитотоксичность, опосредованная естественными клетками-киллерами, усиливается кастаноспермином-индуцированными изменениями гликозилирования IgG. Мол. Иммунол . 26, 1113–1123. DOI: 10.1016 / 0161-5890 (89)

    -2

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Радд П. М., Жоао Х. К., Когхилл Э., Фитен П., Сондерс М. Р., Опденаккер Г. и др. (1994). Гликоформы изменяют динамическую стабильность и функциональную активность фермента. Биохимия 33, 17–22. DOI: 10.1021 / bi00167a003

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Саксон, Э., и Бертоцци, К. Р. (2001). Химические и биологические стратегии инженерного гликозилирования клеточной поверхности. Annu. Rev. Cell Dev. Биол . 17, 1–23. DOI: 10.1146 / annurev.cellbio.17.1.1

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ша С., Агараби К., Брорсон К., Ли Д. Ю. и Юн С. (2016).Дизайн N-гликозилирования и контроль терапевтических моноклональных антител. Trends Biotechnol . 34, 835–846. DOI: 10.1016 / j.tibtech.2016.02.013

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Шилдс, Р. Л., Лай, Дж., Кек, Р., О'Коннелл, Л. Ю., Хонг, К., Мэн, Ю. Г. и др. (2002). Недостаток фукозы в N-связанном олигосахариде человеческого IgG1 улучшает связывание с человеческим Fcgamma RIII и антитело-зависимую клеточную токсичность. J. Biol. Chem . 277, 26733–26740.DOI: 10.1074 / jbc.M202069200

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Шинкава Т., Накамура К., Ямане Н., Сёдзи-Хосака Э., Канда Ю., Сакурада М. и др. (2003). Отсутствие фукозы, но не присутствие галактозы или делящего пополам N-ацетилглюкозамина олигосахаридов комплексного типа человеческого IgG1 показывает критическую роль усиления антителозависимой клеточной цитотоксичности. J. Biol. Chem . 278, 3466–3473. DOI: 10.1074 / jbc.M210665200

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Синклер, А.М., и Эллиотт С. (2005). Гликоинженерия: влияние гликозилирования на свойства терапевтических белков. J. Pharm. Sci . 94, 1626–1635. DOI: 10.1002 / jps.20319

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Соколов, М., Морбиделли, М., Бьют, А., Соке, Дж., И Броли, Х. (2018). Последовательное многомерное моделирование клеточных культур в нескольких масштабах поддерживает систематическое формирование моноклональных антител в направлении качественной цели. Biotechnol.J . 13: e1700461. DOI: 10.1002 / biot.201700461

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сола, Р. Дж., Родригес-Мартинес, Дж. А., и Грибенов, К. (2007). Модуляция биофизических свойств белка путем химического гликозилирования: биохимические идеи и биомедицинские последствия. Cell. Мол. Life Sci . 64, 2133–2152. DOI: 10.1007 / s00018-007-6551-y

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Спан, П. Н., Хансен, А. Х., Хансен, Х.Г., Арнсдорф, Дж., Килдегаард, Х. Ф., и Льюис, Н. Э. (2016). Модель цепи Маркова для N-связанного гликозилирования белка - к низкопараметрическому инструменту для гликоинженерии, управляемой моделями. Metab. Eng . 33, 52–66. DOI: 10.1016 / j.ymben.2015.10.007

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Спан, П. Н., Хансен, А. Х., Кол, С., Волдборг, Б. Г., и Льюис, Н. Е. (2017). Прогнозирующая гликоинженерия биосимиляров с использованием модели гликозилирования цепи Маркова. Biotechnol. J . 12: 1600489. DOI: 10.1002 / biot.201600489

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Спиро, Р. Г. (2002). Гликозилирование белков: природа, распределение, ферментативное образование и влияние гликопептидных связей на заболевание. Гликобиология 12, 43R − 56R. DOI: 10.1093 / гликоб / 12.4.43R

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сунь, Б., Ю, С., Чжао, Д., Го, С., Ван, X., и Чжао, К.(2018). Полисахариды как адъюванты вакцин. Vaccine 36, 5226–5234. DOI: 10.1016 / j.vaccine.2018.07.040

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Теджвани В., Андерсен М. Р., Нам Дж. Х. и Шарфштейн С. Т. (2018). Гликоинженерия в клетках СНО: достижения в системной биологии. Biotechnol. J . 13: e1700234. DOI: 10.1002 / biot.201700234

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Toll, H., Berger, P., Hofmann, A., Hildebrandt, A., Oberacher, H., Lenhof, H.P., et al. (2006). Паттерны гликозилирования хорионического гонадотропина человека, выявленные методами жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии и биоинформатики. Электрофорез 27, 2734–2746. DOI: 10.1002 / elps.200600022

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Цутия, Н., Эндо, Т., Мацута, К., Йошиноя, С., Айкава, Т., Косуге, Э. и др. (1989). Влияние истощения галактозы из олигосахаридных цепей на иммунологическую активность человеческого IgG. Дж. Ревматол . 16, 285–290.

    PubMed Аннотация | Google Scholar

    Умана П. и Бейли Дж. Э. (1997). Математическая модель биосинтеза N-связанных гликоформ. Биотехнология Биоенг . 55, 890–908. DOI: 10.1002 / (SICI) 1097-0290 (19970920) 55: 6 <890 :: AID-BIT7> 3.0.CO; 2-B

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Умана П., Жан-Майре Дж., Мудри Р., Амштуц Х. и Бейли Дж. Э. (1999). Сконструированные гликоформы антинейробластомы IgG1 с оптимизированной антителозависимой клеточной цитотоксической активностью. Nat. Биотехнология . 17, 176–180. DOI: 10.1038 / 6179

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ван ден Стин, П., Радд, П. М., Двек, Р. А., и Опденаккер, Г. (1998). Понятия и принципы O-связанного гликозилирования. Crit. Rev. Biochem. Мол. Биол . 33, 151–208. DOI: 10.1080 / 1040

    198

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ван, Л. X., Тонг, X., Ли, К., Гидденс, Дж. П., и Ли, Т.(2019). Гликоинженерия антител для модуляции функций. Annu. Ред. Biochem . 88, 433–459. DOI: 10.1146 / annurev-biochem-062917-012911

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Wang, P., Dong, S., Shieh, J.H., Peguero, E., Hendrickson, R., Moore, M.A.S, et al. (2013). Эритропоэтин, полученный химическим синтезом. Наука 342, 1357–1360. DOI: 10.1126 / science.1245095

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ван, К., Чанг, С. Ю., Чоу, С., Бетенбо, М. Дж. (2018). Стратегии гликоинженерии антител в клетках млекопитающих. Biotechnol. Bioeng . 115, 1378–1393. DOI: 10.1002 / бит 26567

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Washburn, N., Schwab, I., Ortiz, D., Bhatnagar, N., Lansing, J.C., Medeiros, A., et al. (2015). Контролируемое тетра-Fc сиалирование IVIg приводит к получению кандидата в лекарство с постоянно повышенной противовоспалительной активностью. Proc. Natl. Акад. Sci.США . 112, E1297–306. DOI: 10.1073 / pnas.1422481112

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Вэй, Ю., Ли, К., Хуанг, В., Ли, Б., Стром, С., и Ван, Л. X. (2008). Гликоинженерия человеческого IgG1-Fc посредством комбинированной дрожжевой экспрессии и хемоферментного гликозилирования in vitro. Биохимия 47, 10294–10304. DOI: 10.1021 / bi800874y

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Вен, Л., Эдмундс, Г., Гиббонс, К., Zhang, J., Gadi, M. R., Zhu, H., et al. (2018). На пути к автоматизированному ферментативному синтезу олигосахаридов. Chem. Ред. . 118, 8151–8187. DOI: 10.1021 / acs.chemrev.8b00066

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Райт А. и Моррисон С. Л. (1997). Влияние гликозилирования на функцию антител: значение для генной инженерии. Trends Biotechnol . 15, 26–32. DOI: 10.1016 / S0167-7799 (96) 10062-7

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Wu, C.Y., Lin, C. W., Tsai, T. I., Lee, C. D., Chuang, H. Y., Chen, J. B., et al. (2017). Гликозилирование поверхности гриппа A и дизайн вакцины. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 114, 280–285. DOI: 10.1073 / pnas.1617174114

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ямане-Охнуки, Н., Киношита, С., Иноуэ-Уракубо, М., Кусуноки, М., Иида, С., Накано, Р. и др. (2004). Создание клеток яичника китайского хомячка с нокаутом FUT8: идеальная линия клеток-хозяев для получения полностью дефукозилированных антител с повышенной антителозависимой клеточной цитотоксичностью. Biotechnol. Bioeng . 87, 614–622. DOI: 10.1002 / bit.20151

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Янг Ю., Лю Ф., Франк В., Халим Л. А., Шеллекенс Х. и Хек А. Дж. (2016). Подходы гибридной масс-спектрометрии в анализе гликопротеинов и их использование для оценки биоподобия. Nat. Коммуна . 7: 13397. DOI: 10.1038 / ncomms13397

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Йейтс, Л. Э., Миллс, Д. К., и Делиза, М. П. (2018). «Бактериальная гликоинженерия как биосинтетический путь к индивидуализированным гликомолекулам», в Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology (Берлин; Гейдельберг: Springer), 1–34. DOI: 10.1007 / 10_2018_72

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Zhang, P., Woen, S., Wang, T., Liau, B., Zhao, S., Chen, C., et al. (2016). Проблемы анализа и контроля гликозилирования: комплексный подход к производству оптимальных и последовательных терапевтических препаратов. Drug Discov. Сегодня 21, 740–765. DOI: 10.1016 / j.drudis.2016.01.006

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Специальный выпуск: вычислительные исследования в области анализа и прогнозирования свойств белков

    Уважаемые коллеги,

    Белки - это макромолекулы, необходимые для биологической жизни. Они играют важную роль в бесчисленных биологических процессах, например, они участвуют в репликации ДНК, катализе и регулировании биохимических реакций и сетей, метаболических путях, активном транспорте молекул, сигнальном процессе, фотосинтетическом преобразовании света в растениях и т. Д. на.Функцию и свойства белка можно понять с точки зрения его трехмерной структуры. Установление взаимосвязи между структурой белка и функцией имеет решающее значение для понимания его биологической функции. Экспериментальные методы (например, рентген, ЯМР, SAXS и Cryo-EM) использовались для предсказания структуры белка в растворе и кристаллическом состоянии, а также для понимания механизмов, определяющих функцию белков; однако определение структуры и динамики больших белковых комплексов и других биомолекулярных ансамблей остается серьезной проблемой в структурной биологии и биохимии.Кроме того, ни один метод - экспериментальный или вычислительный - не может охватить все соответствующие масштабы клеточной функции. Вычислительная структурная биология достигла огромных успехов за последние три десятилетия. Эти методы включают молекулярное моделирование и уточнение трехмерных структур, дизайн белков de novo, укладку и стабильность белков, макромолекулярную функцию и дизайн белка и прогнозирование макромолекулярных взаимодействий, моделирование взаимодействий белок-белок и лиганд с различными пространственными разрешениями и временными масштабами.Кроме того, вычислительные методы также решают вычислительные задачи, связанные с экспериментальными методами в структурной биологии или биохимии и вычислительным дизайном кристалла белка. Параллельно с массовым применением экспериментальных методов для определения сетей взаимодействия белков и белковых комплексов растет интерес к разработке вычислительных методов, основанных на информации о последовательностях и геноме. Мы ожидаем, что в будущем будут разработаны более интегративные методы и инструменты для прогнозирования структуры белков, взаимодействия и сетевого анализа, а также методологические разработки для использования имеющихся экспериментальных данных с использованием методов машинного обучения.

    Приглашенный редактор надеется собрать ряд последних достижений в смежных темах, чтобы предоставить платформу для исследователей и преодолеть разрыв между исследователями вычислительной техники и исследователями-экспериментаторами. Мы ищем вклады от сообществ вычислительной и структурной биологии, биохимии, биоинформатики и биофизики в виде оригинальных статей или обзорных статей, охватывающих, помимо прочего, следующие темы:

    • Прогноз структуры белка
    • Взаимодействие с белками
    • Взаимодействия белок-лиганд
    • Белок-углеводные взаимодействия
    • Белковые взаимодействия
    • Стабильность и сворачивание белка
    • Белок-углеводные взаимодействия
    • Взаимодействия белок-ДНК
    • Агрегация белков
    • Белковая конструкция

    Др.Мехди Давари
    Приглашенный редактор

    Информация для подачи рукописей

    Рукописи должны быть представлены онлайн на сайте www.mdpi.com, зарегистрировавшись и войдя на этот сайт. После регистрации щелкните здесь, чтобы перейти к форме отправки. Рукописи можно подавать до установленного срока. Все статьи будут рецензироваться. Принятые статьи будут постоянно публиковаться в журнале (как только они будут приняты) и будут перечислены вместе на веб-сайте специального выпуска.Приглашаются исследовательские статьи, обзорные статьи, а также короткие сообщения. Для запланированных статей название и краткое резюме (около 100 слов) можно отправить в редакцию для объявления на этом сайте.

    Представленные рукописи не должны были публиковаться ранее или рассматриваться для публикации в другом месте (за исключением трудов конференции). Все рукописи проходят тщательное рецензирование путем слепого рецензирования. Руководство для авторов и другая важная информация для подачи рукописей доступна на странице Инструкции для авторов. Crystals - это международный рецензируемый ежемесячный журнал с открытым доступом, публикуемый MDPI.

    Пожалуйста, посетите страницу Инструкции для авторов перед отправкой рукописи. Плата за обработку статьи (APC) для публикации в этом журнале с открытым доступом составляет 1800 швейцарских франков. Представленные документы должны быть хорошо отформатированы и написаны на хорошем английском языке. Авторы могут использовать MDPI Услуги редактирования на английском языке перед публикацией или во время редактирования автора.

    Свойства целевых классов белковых препаратов

    Сравнение идентичности последовательностей

    Большинство алгоритмов удаления избыточности из набора данных белков определяют расстояние между двумя белками в наборе данных как функцию их последовательностей.Однако при попытке вызвать классификатор с использованием набора данных белки встраиваются в пространство, определяемое функциями набора данных. Таким образом, расстояние между двумя белками в этом пространстве определяется векторами признаков, которые их определяют, и используемым алгоритмом классификации, и может не зависеть от расстояния сходства последовательностей. Следовательно, расстояние между двумя белками во время удаления избыточности может существенно отличаться от расстояния между ними во время индукции классификатора.Если различия в показателях расстояния приводят к тому, что белки, расположенные на большом расстоянии в пространстве признаков, будут считаться алгоритмом удаления избыточности слишком похожими, то удаление одного из слишком похожих белков может привести к тому, что информация о распределении белков в пространстве признаков может измениться. быть потерянным в ущерб возможностям индуцированного классификатора.

    Чтобы оценить влияние, которое разница между двумя измерениями расстояния оказывает на индукцию классификатора, были сгенерированы неизбыточные наборы данных с использованием нескольких пороговых значений идентичности последовательностей, которые затем использовались для индукции RF.Поскольку более низкий порог идентификации последовательности приводит к большей разнице между исходным набором данных и неизбыточным, сгенерированным из него, использование диапазона пороговых значений позволяет оценить возможности классификатора, когда удаление избыточности имеет разные уровни влияния на набор данных. используется для обучения (неизбыточный набор данных). Чтобы сравнить возможности индуцированных классификаторов, они использовались для классификации белков во всем наборе данных, из которого был сгенерирован их неизбыточный набор обучающих данных.Это позволяет оценивать RF, индуцированный с использованием неизбыточного набора данных, с точки зрения его способности обобщать на весь набор данных, и, следовательно, допускает потерю информации о распределении белков в пространстве признаков, вызванную удалением избыточности, быть оцененным.

    При классификации белков в неизбыточном наборе данных Cancer пороговое значение, используемое для создания набора данных, не имело большого значения, о чем свидетельствует тот факт, что все индуцированные RF имеют средние G в пределах 0.02 друг от друга (таблица 2). Средние G классификаций белков во всем наборе данных Cancer демонстрируют несколько большее разброс, но поскольку самое низкое среднее значение G не более чем на 0,03 ниже, чем достигается RF, связанным со 100% порогом, процесс удаления избыточности вряд ли приведет к значительной потере информации во всем наборе данных Cancer . Несмотря на это, набор данных, созданный с использованием порога 20%, индуцировал RF, который классифицировал неизбыточные белки с большим средним G, чем весь набор белков.Следовательно, вероятно, что использование этого конкретного порога привело к тому, что распределение белков в неизбыточном наборе данных отличалось от распределения белков во всем наборе данных. Граница принятия решения, индуцированная с использованием неизбыточного набора данных, тогда соответствовала бы белкам во всем наборе данных хуже, чем это делает те, что в неизбыточном наборе данных, тем самым приводя RF к переобучению неизбыточного набора данных до точки, где он классифицирует весь набор данных. набор данных с более низким средним значением G.

    Порог, используемый для создания набора данных без избыточности GPCR , оказал существенное влияние на классификации белков как в неизбыточном обучающем наборе, так и во всем наборе данных GPCR , при этом меньшие пороги обычно приводят к индукции RF со средним нижним G (таблица 3).Несмотря на эту тенденцию, наибольшее среднее значение G для неизбыточных наборов данных связано с порогом в 20%. Вероятно, это связано с тем, что большая часть белков удаляется на этом пороге, что приводит к тому, что оставшиеся белки редко распределяются по пространству признаков, тем самым упрощая оптимизацию границы принятия решений для соответствия распределению неизбыточных белков. В дополнение к этому, пороговые значения 20% и 30% приводят к индукции RF, которые классифицируют неизбыточные белки с большим средним G, чем весь набор белков.Как и в случае с другими наборами данных, это, вероятно, связано с тем, что подмножество белков, сохраняемых за счет удаления избыточности, имеет другое распределение по сравнению с белками во всем наборе данных, что приводит к тому, что RF переоснащает неизбыточный набор данных до точки, где он классифицирует белки во всем наборе данных с более низким средним значением G. В отличие от 20% и 30%, пороговые значения между 40% и 90% привели к появлению RF, которые работали лучше на всем наборе данных GPCR , чем на неизбыточном наборе данных, на котором они были обучены.Вероятно, это происходит из-за удаления избыточности, преимущественно из-за утончения кластеров белков в пространстве признаков, которые принадлежат к одному классу, тем самым непропорционально удаляя те белки, которые легче классифицировать, и тем самым уменьшая G-среднее. В этом случае распределение белков в неизбыточном наборе данных будет аналогично распределению белков во всем наборе данных. Таким образом, неизбыточный набор данных по-прежнему будет содержать достаточно информации для правильной классификации подавляющего большинства удаленных белков, и в результате среднее значение G будет больше при классификации всего набора данных.Кроме того, это показывает, что при этих порогах меры удаления избыточности и классификационного расстояния хорошо коррелируют, вызывая удаление избыточности для удаления белков, которые оба похожи с точки зрения идентичности последовательностей и их местоположения в пространстве признаков.

    Результаты для наборов данных IonChannel (Таблица 4), Kinase (Таблица 5) и Protease (Таблица 6) показывают те же общие тенденции, что и Cancer и GPCR , например, меньше изменение в G означает классификацию неизбыточных наборов данных и более высокие пороговые значения, ведущие к индукции RF, которые лучше классифицируют весь набор данных.Все три набора данных также демонстрируют ту же тенденцию, что как только порог ниже определенного значения, 50% в случае набора данных IonChannel и 40% в случае наборов данных Kinase и Protease , среднее значение G классификации всего набора данных становятся значительно меньше среднего G классификаций неизбыточного набора данных. Подобно наборам данных Cancer и GPCR , это, вероятно, связано с различиями в распределении белков в неизбыточном наборе данных и во всем наборе данных.

    Несмотря на обсуждаемые общие черты в результатах для пяти наборов данных, существует явное различие между влиянием, которое удаление избыточности оказывает на набор данных Cancer , и влиянием, которое оно оказывает на наборы данных на основе принадлежности к семейству белков. Это легче всего увидеть, сравнив долю белков во всем наборе данных, которые остаются после удаления избыточности (таблица 7). Для всех пороговых значений, кроме 90%, набор данных Cancer имеет наибольшую долю оставшихся белков, вероятно, из-за более гетерогенной природы белков в наборе данных, что приводит к меньшему внутриклассовому сходству между белками.Эта более низкая доля удаленных белков также, вероятно, ответственна за различия в пороге, при котором индуцированные RF классифицируют белки в неизбыточном наборе данных с большим средним G, чем во всем наборе данных, а также за эффективность индуцированных RF. из неизбыточных наборов данных Cancer деградирует гораздо медленнее, чем вызванные наборами данных на основе неизбыточных семейств белков.

    Целевые свойства

    Все белки.

    Результаты анализа функций в наборе данных AllTargets можно увидеть в таблице 8.По сравнению с немечеными белками в наборе данных положительные белки пропорционально более неполярны ( PS = 0,65). Из отдельных аминокислотных соотношений единственными неполярными аминокислотами, которые встречаются в большей пропорции в немеченых белках, являются цистеин и пролин, а единственными полярными аминокислотами, которые встречаются в большей пропорции в положительных белках, являются аспарагин, аспарагиновая кислота и треонин. . Однако, поскольку величина эффекта для всех из них либо мала, либо очень мала, можно видеть, что различия в пропорциях отдельных аминокислот в значительной степени соответствуют разнице в пропорциях неполярных аминокислот.Хотя влияние различий в неполярных и отдельных аминокислотах невелико, вместе они указывают на то, что положительные белки постоянно более неполярны, чем немеченые. Это дополнительно демонстрируется тем фактом, что положительные белки умеренно более гидрофобны ( PS = 0,67), как и следовало ожидать, из-за большей доли неполярных аминокислот и меньшей доли полярных. Поскольку положительные белки с большей вероятностью содержат трансмембранную спираль (43% положительных белков по сравнению с 24% немеченых), как правило, имеют большее количество трансмембранных α -спиралей ( PS = 0.60) и имеют больший процент своих остатков в скрытых α -спиралях ( PS = 0,66), результаты аминокислотного состава, вероятно, связаны с мембранными белками, составляющими большую часть набора положительных белков. Возможно, это неудивительно из-за большой доли мембранных белков (например, GPCR и транспортных белков), на которые, как полагают, нацелены одобренные лекарства, а также из-за жизненно важной роли в транспорте и передаче сигнала, которую играют многие мембранные белки. Помимо пропорций аминокислот, единственной другой характеристикой, оказывающей заметный эффект, было количество N -связанных сайтов гликозилирования.Поскольку N -связанное гликозилирование связано с повышенной стабильностью белка и защитой от деградации и денатурации, помимо обеспечения правильного фолдинга белков [50,51], большее количество N -связанных сайтов гликозилирования, вероятно, указывает на то, что положительные белки имеют больший период полужизни in vivo . Гликозилирование также очень сильно связано с трансмембранным или секретируемым белком.

    Взаимодействие с белками и данные о путях из KEGG [52], Reactome [53] и STRING [54] также были проанализированы для белков в наборе данных.Однако низкий охват этих баз данных сделал невозможным точный анализ белков в наборе данных. Анализ обогащения терминов Gene Ontology [55] между немечеными и положительными белками также был исследован с использованием инструмента функциональной аннотации DAVID [56]. Однако при установлении фона для немеченых белков и поиске терминов, обогащенных положительными белками, не было обнаружено, что термины значительно обогащены. Идентичные результаты были также получены при установке фона для положительных белков и проверке обогащения немечеными белками или при использовании всего протеома в качестве набора фона.

    Раковые белки.

    Результаты анализа признаков в наборе данных Cancer можно увидеть в таблице 9. По сравнению с немечеными белками в наборе данных, положительные имеют гораздо большую долю неполярных аминокислот ( PS = 0,74). Кроме того, единственными полярными аминокислотами, которые встречаются в большей пропорции в положительных белках, являются аспарагин и треонин (оба из которых имеют несущественные различия в их пропорциях), в то время как пролин является единственной неполярной аминокислотой, которая встречается в большей пропорции в немеченых. белки.Положительные белки также значительно более гидрофобны ( PS = 0,82), как и следовало ожидать из-за большей доли неполярных аминокислот и меньшей доли полярных. Поскольку положительные белки с большей вероятностью содержат трансмембранную спираль, чем немеченые (55% по сравнению с 11%), обычно имеют гораздо большее количество трансмембранных спиралей ( PS = 0,73) и имеют гораздо больший процент их остатков в захоронено α -спирали ( ПС = 0.75), результаты аминокислотного состава, вероятно, связаны с мембранными белками, составляющими большую часть набора положительных белков.

    Поскольку вход в секреторный путь у человека контролируется присутствием сигнального пептида на N-конце белка, положительные белки будут секретироваться немного более вероятно, чем немеченые белки из-за их повышенной вероятности содержания сигнального пептида ( PS = 0,61). Кроме того, положительные белки в наборе данных Cancer , вероятно, будут иметь более длительный период полужизни in vivo из-за большего количества сайтов гликозилирования, связанных с N ( PS = 0.71), которые были связаны с более длительным периодом полужизни in vivo и меньшим количеством мотивов PEST ( PS = 0,40), которые связаны с белками с более коротким внутриклеточным периодом полужизни [57].

    Результаты также показывают, что специфическая и надежная активность ракового белка, вероятно, важна для его воздействия противоопухолевыми препаратами. Одним из примеров этого является меньшее количество 5 ’непереведенных ( PS, = 0,34), 3’ непереведенных ( PS = 0.32) и несинонимичные кодирующие ( PS = 0,38) варианты, которые обнаруживаются в положительных белках. Поскольку нетранслируемые области гена важны для регуляции трансляции мРНК и экспрессии белка [58], а несинонимичные кодирующие варианты могут приводить к изменениям экспрессии и структуры / функции белка, активность белка с меньшим количеством этих вариантов вероятно, будет более согласованным между людьми.

    Дальнейшие примеры предпочтения белков с надежной активностью происходят из меньшего количества сайтов фосфорилирования ( PS = 0.40), бинарные PPI ( PS, = 0,42) и области низкой сложности ( PS = 0,38), которые обнаруживаются в положительных белках. Поскольку фосфорилирование белков в раковых клетках часто изменяется, при наличии меньшего количества сайтов фосфорилирования возможно, что положительные белки будут меньше подвержены аберрантному фосфорилированию, тем самым гарантируя, что их активность и ее регуляция минимально затронуты раковым микроокружением. В этом свете также можно увидеть участие в меньшем количестве бинарных ИПП, поскольку ограниченный набор взаимодействий может сделать активность белка менее восприимчивой к изменениям активности или регуляции других белков.Точно так же было показано, что белки, содержащие участки низкой сложности, имеют больше партнеров по связыванию [59], что белки-концентраторы в сетях PPI содержат значительно больше участков низкой сложности [60,61] и что многие известные неупорядоченные области в белках участвуют в передаче сигналов и регулирование [62]. Следовательно, кажется вероятным, что области низкой сложности позволяют белку более легко взаимодействовать с другими белками, будь то сигнальная или регуляторная способность. Их меньшее количество может указывать на то, что белок участвует в меньшем количестве взаимодействий с другими белками, что, в свою очередь, означает, что активность и экспрессия белка менее подвержены модификации со стороны злокачественного микроокружения.

    Меньшее количество вариантов зародышевой линии всех типов в положительных белках, возможно, является отражением предрасположенности к раку, вызванного некоторыми вариантами зародышевой линии, или может указывать на то, что меньшее количество жизнеспособных вариантов зародышевой линии означает, что белок менее подвержен соматическим мутациям, которые оставляют белок функциональный. Это было бы выгодно для противоопухолевой мишени, поскольку микроокружение рака повышает вероятность возникновения генетических мутаций в гене, кодирующем данный белок.Если эти мутации оставляют белок функциональным, то лекарства, нацеленные на этот белок, могут иметь неожиданные эффекты. За счет нацеливания на белки, которые менее восприимчивы к мутациям, которые делают их жизнеспособными, действие противоопухолевого препарата будет более надежным, поскольку экспрессия и функция самого белка более надежны.

    Экспрессия положительных белков в меньшем количестве участков тела ( PS = 0,34) означает, что эффекты модулирующей активности лекарственного средства могут быть ограничены более конкретным диапазоном тканей.Это может не только помочь ограничить нежелательные побочные эффекты, но и ограничить действие препарата узким кругом тканей, из которых происходят раковые клетки. Это может быть особенно важно для противоопухолевых препаратов, поскольку они часто могут быть более вредными для нормальных клеток, чем неантинеопластические препараты.

    GPCR.

    Результаты анализа признаков в наборе данных GPCR можно увидеть в таблице 10. Учитывая размер и состав набора данных GPCR , по сравнению с другими исследованными наборами данных, количество признаков со значимым эффектом размеры на удивление велики.Это свидетельствовало либо о существенных различиях между положительными и немечеными белками, либо о большой субпопуляции GPCR (скорее всего, немеченых), которые значительно отличаются от других белков в наборе данных. Вероятным претендентом на эту субпопуляцию являются одорантные / обонятельные GPCR. В то время как одоранты GPCR ограничены клетками, специализирующимися на обнаружении внешних стимулов, например запахи и вкусы, непахучие GPCR по-разному экспрессируются в организме, отвечают на множество эндогенных лигандов и регулируют различные жизненно важные физиологические процессы [63].Следовательно, препараты GPCR, не содержащие одорантов, с большей вероятностью могут стать мишенью для лекарств. Анализ набора данных GPCR подтверждает это предположение, поскольку из 421 одоранта GPCR в наборе данных ни один не был классифицирован как потенциальная мишень для лекарства или был мишенью для одобренного лекарства.

    Чтобы оценить влияние одорантов GPCR на анализ признаков, второй набор данных, GPCR_NO , был построен из набора данных GPCR путем удаления из него всех одорантов.Результаты анализа этого второго набора данных можно увидеть в Таблице 11. Для всех характеристик, за исключением доли остатков в экспонированных α -спиралях, размер эффекта был меньше в наборе данных GPCR_NO , чем в GPCR набор данных. Кроме того, было сочтено, что только пять функций имеют существенные различия по сравнению с тридцатью семью функциями в наборе данных GPCR .

    По сравнению с немечеными белками, положительные белки в наборе данных GPCR_NO имеют немного меньшую долю неполярных аминокислот ( PS = 0.43) и более низкой гидрофобностью ( ПС = 0,38). Положительные белки в наборе данных GPCR_NO также имели немного более высокую длину последовательности, чем немеченые ( PS = 0,59). Поскольку GPCR содержат семь трансмембранных областей, а положительные белки имеют немного меньшую долю остатков в скрытых α -спиралях ( PS = 0,44), разница в длине последовательности, вероятно, связана с положительными белками, имеющими больше внеклеточных и внутриклеточных остатков.В отличие от аминокислот в трансмембранных областях, нетрансмембранные остатки, вероятно, будут более гидрофильными, поскольку они подвергаются воздействию внеклеточной и внутриклеточной среды, а не встраиваются в мембрану. Вероятно, это объясняет меньшую долю неполярных и ароматических аминокислот в положительных белках и их более низкую гидрофобность. Точно так же большая доля заряженных и отрицательно заряженных аминокислот в положительных белках, вероятно, связана с увеличением длины последовательности.

    Ионных каналов.

    Результаты анализа признаков в наборе данных IonChannel можно увидеть в Таблице 12. Различия между положительными и немечеными белками с точки зрения их аминокислотных соотношений минимальны, с небольшой разницей в пропорции неполярные аминокислоты ( PS = 0,43). Тенденция положительных белков иметь немного меньшую долю неполярных аминокислот, вероятно, может быть объяснена большей длиной последовательности положительных белков ( PS = 0.61). Поскольку разница в количестве трансмембранных спиралей в положительных и немеченых белках минимальна ( PS = 0,48), а положительные белки имеют меньшую долю остатков в скрытых α -спиралях ( PS = 0,41), тем длиннее Длина последовательности положительных белков, вероятно, может быть объяснена тем, что они имеют больше остатков во внутри- и / или внеклеточном пространстве. В отличие от аминокислот в трансмембранных областях, эти остатки, вероятно, будут более гидрофильными, поскольку они подвергаются воздействию внеклеточной и внутриклеточной среды, а не встраиваются в мембрану.Следовательно, положительные белки будут иметь немного меньшую долю неполярных аминокислот.

    Повышенное количество внеклеточных и внутриклеточных аминокислот может также объяснить тенденцию положительных белков иметь повышенное количество гликозилирования, связанного с N ( PS = 0,68), фосфосерина ( PS = 0,58) и общего сайты фосфорилирования ( PS = 0,57). Чтобы проверить это, PS трех признаков был протестирован после учета длины белка (путем деления значения признака для белка на количество остатков в его последовательности).После этого положительные белки все еще имели более высокие значения для сайтов N -связанного гликозилирования ( PS = 0,68), фосфосерина ( PS = 0,56) и общего фосфорилирования ( PS = 0,55). Однако эффект для сайтов фосфосерина и общего фосфорилирования сейчас слишком мал, чтобы быть значимым, что указывает на то, что без разницы в длине последовательности, вероятно, не будет никакого последующего эффекта для сайтов фосфосерина или общего фосфорилирования. В отличие от сайтов фосфорилирования, PS сайтов гликозилирования, связанных с N , остается неизменным после учета различий в длине последовательностей, что означает, что положительные ионные каналы, вероятно, будут иметь более высокие периоды полужизни in vivo и . стабильный.Из-за того, что они с большей вероятностью содержат сигнальный пептид, каналы положительных ионов также с большей вероятностью будут секретироваться.

    киназ.

    Результаты анализа признаков в наборе данных киназы можно увидеть в Таблице 13. Хотя результаты показывают, что существуют значительные различия между положительными и немечеными белками, существенные различия в их составах, особенно гораздо большие. доля тирозинкиназ в положительных белках (таблица 14) потенциально влияет на результаты.Значительные различия, наблюдаемые для набора данных киназы , могут быть просто отражением различий между серин / треонин и тирозинкиназами. Хотя присутствие киназ неизвестного типа несколько усложняет это обобщение, в целом значения их характеристик близко соответствуют значениям серин / треониновых киназ, а не тирозиновых. Поэтому они, вероятно, будут в лучшем случае нейтральными в отношении различий между серин / треонин и тирозинкиназами.

    Влияние различий между типами киназ было оценено путем создания двух новых наборов данных. Набор данных Kinase_TK был построен из набора данных Kinase путем удаления всех положительных белков, которые не были тирозинкиназами, в то время как набор данных Kinase_NTK был построен из набора данных Kinase путем удаления всех положительных белков, которые были тирозинкиназами. Оба этих набора данных проанализировали свои особенности с точки зрения значимости и размера эффекта.Сравнение характеристик, значимых в каждом из трех наборов данных, можно увидеть в Таблице 15. Для каждой функции можно увидеть, что отклонение размера эффекта от 0,5 в наборе данных Kinase находится между отклонениями для Наборы данных Kinase_TK и Kinase_NTK . Однако, если положительные серин / треонин и тирозинкиназы обладали схожими свойствами, то можно было бы ожидать, что признаки с наибольшими отклонениями в величине эффекта в наборе данных киназы будут иметь наибольшие отклонения в наборах данных Kinase_TK и Kinase_NTK .Таким образом, характер отклонений указывает на наличие явных различий между положительными серин / треонинкиназами и положительными тирозиновыми киназами. Кроме того, можно видеть, что положительные тирозинкиназы доминируют над эффектами, наблюдаемыми в наборе данных Kinase , поскольку набор данных Kinase_TK показывает очень большие отклонения для тех характеристик, которые значимы в наборе данных Kinase , тогда как набор данных Kinase_NTK имеет для них очень небольшие отклонения.Кроме того, из девяти значимых функций в наборе данных Kinase все девять оказались значимыми в наборе данных Kinase_TK , в то время как ни одна не была значимой в наборе данных Kinase_NTK . Эти результаты показывают, что различия между положительными и немечеными белками в наборе данных киназы , скорее всего, являются следствием состава набора данных, а не истинным отражением свойств, которые делают киназу подходящей мишенью для лекарственного средства.

    Несмотря на то, что весь набор киназ непригоден для анализа, возможно, что информативные различия могут быть обнаружены путем сравнения положительных тирозинкиназ с немечеными. Однако, помимо различий между серин / треонин и тирозинкиназами, набор данных киназы также имеет смещенный набор положительных тирозинкиназ. Хотя можно предположить, что это смещение связано с предпочтением рецепторных тирозинкиназ из-за того, что мишени лекарственных средств преимущественно связаны с мембраной, доля рецепторных тирозинкиназ в положительных белках и в наборе всех тирозинкиназ очень похожа.Скорее, источником систематической ошибки является конкретное заболевание, для лечения которого предназначены препараты, нацеленные на тирозинкиназы: рак. Из сорока положительных тирозинкиназ тридцать четыре являются мишенью противоопухолевого препарата, а еще три причинно связаны с раком (и, следовательно, в наборе данных Cancer ). Однако только четыре из пятидесяти немеченых тирозинкиназ причинно связаны с раком. Таким образом, любое сравнение положительных и немеченых тирозинкиназ является скорее сравнением между теми тирозинкиназами, которые участвуют в развитии рака, и теми, которые не участвуют.

    Хотя положительные серин / треониновые киназы не имеют столь очевидных смещений, как у тирозинкиназ, их очень мало. Кроме того, эти киназы могут быть нерепрезентативными, поскольку они могли быть выбраны в качестве ранних мишеней по определенным причинам, например свойства, которыми они обладают, которые не будут экстраполированы на будущие цели. Следовательно, пока набор положительных киназ не станет более репрезентативным или набор положительных серин / треониновых киназ не увеличится в размерах, будет трудно получить точную картину свойств, которые делают общую киназу подходящей мишенью для лекарственного средства, кроме ингибирование переноса фосфорильной группы с нуклеотидов.

    Протеазы.

    Результаты анализа признаков в наборе данных Protease можно увидеть в таблице 16. Хотя эти результаты показывают, что могут быть обнаружены значительные различия между положительными и немечеными белками, необходимо соблюдать осторожность из-за состава набор положительных белков. Поскольку 61% положительных белков являются металлопротеазами, возможно, что различия в наборах данных отражают различия между конкретным подмножеством металлопротеаз (положительные белки) и протеазами в целом (немеченые).Это вызывает особую озабоченность из-за высокого уровня сходства положительных металлопротеаз и низкого уровня сходства между положительными металло- и неметаллопротеазами. Чтобы оценить эффект этой субпопуляции положительных металлопротеаз, были построены еще два набора данных. Набор данных Protease_MP был построен из набора данных Protease путем удаления всех положительных белков, которые не были металлопротеазами, в то время как набор данных Protease_NMP был построен из набора данных Protease путем удаления всех положительных белков, которые были металлопротеазами.Характеристики обоих этих наборов данных были проанализированы с точки зрения значимости и размера эффекта. Сравнение характеристик, которые являются значимыми в каждом из трех наборов данных, можно увидеть в таблице 17. Для каждой функции отклонение размера эффекта от 0,5 в наборе данных Protease также может быть между отклонениями для Protease_MP и Protease_NMP , за исключением доли глутамина и синонимичных вариантов кодирования. Однако, если положительные металлопротеазы и неметаллопротеазы обладали схожими свойствами, то можно было бы ожидать, что признаки с наибольшими отклонениями величины эффекта в наборе данных Protease будут иметь наибольшие отклонения в наборах данных Protease_MP и Protease_NMP .Таким образом, различный характер отклонений указывает на наличие явных различий между положительными металлопротеазами и положительными неметаллопротеазами. Наиболее отчетливо это можно увидеть в пропорции цистеина в белках: наборы данных Protease_MP и Protease_NMP оказывают на него заметное влияние, но положительные белки имеют большую долю цистеина в наборе данных Protease_NMP и меньшая доля в Protease_MP .Кроме того, из десяти значимых функций в наборе данных Protease восемь оказались значимыми в наборе данных Protease_MP и только одна значима в наборе данных Protease_NMP . Эти результаты показывают, что различия в наборе данных Protease , вероятно, отражают различия между положительными металлопротеазами и немечеными протеазами, а не захватывают свойства протеазных лекарственных мишеней в целом.

    Поскольку металлопротеазы (как положительные, так и немеченые), по-видимому, группируются вместе, одним из способов преодоления проблем с набором данных Protease может быть сравнение положительных металлопротеаз с немечеными.То же самое можно было бы затем сделать для неметаллопротеаз или, альтернативно, для дополнительных подмножеств набора данных Protease (например, сериновых протеаз). Однако этот подход был бы проблематичным из-за небольшого размера набора положительных белков, поскольку существует только тридцать шесть положительных металлопротеаз, и возможного предубеждения в отношении того, что определенные металлопротеазы были выбраны в качестве ранних мишеней из-за их специфических свойств или простота нацеливания на них. Следовательно, необходимо больше положительных протеаз, чтобы точно определить свойства мишеней протеазных лекарственных средств.

    Целевые прогнозы.

    После оптимизации параметров набора данных RF был обучен на наборе данных и использован для классификации белков в нем. Классификация отдельного белка состояла из двух частей: взвешенного голоса РФ за немаркированный класс и взвешенного голоса за положительный класс. По этим двум значениям можно рассчитать положительное сходство белка как долю от общего количества голосов РФ за положительный класс. Это сходство можно рассматривать как уверенность RF в его предсказании и, следовательно, можно использовать как меру сходства белка-мишени для лекарственного средства.Окончательная классификация белка затем может быть определена по его сходству путем определения порогового значения, так что белки классифицируются как положительные, только если они имеют положительное сходство выше порогового значения. Здесь использовалось пороговое значение 0,5, поскольку большее сходство указывает на то, что большинство голосов РФ было за положительный класс.

    Все белки.

    Лучшее сочетание параметров и набора функций для классификации белков в наборе данных AllTargets было numberTrees = 1000, mtry = 5, вес 110, присвоенный каждому наблюдению в положительном классе, случайное начальное число из 307972627

    44970 и сорок функций из исходных 105 (дополнительная информация S3).Положительное сходство белков в наборе данных AllTargets можно увидеть на рис. 1. Используя пороговое значение 0,5, предсказанные RF классификации показаны в таблице 18.

    Рис. 1. Взвешенные прогнозы белков в наборе данных AllTargets .

    Положительное сходство данного белка равно доле голосов леса за положительный класс. Значения над столбцами указывают количество белков в ячейке (в необработанных числах для положительных (черных) столбцов и в тысячах для немеченых (серых) столбцов).Набор данных AllTargets содержал 18919 немеченых белков и 1324 положительных.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0117955.g001

    Среднее значение G 0,78 указывает на то, что у RF возникли некоторые трудности с классификацией белков в наборе данных AllTargets . Хотя это может быть связано с неадекватностью RF для задачи, производительность RF на других наборах данных указывает, что это более вероятно из-за самого набора данных AllTargets .Поскольку набор данных AllTargets содержит гетерогенный набор белков, из-за отсутствия дополнительных критериев членства может быть сложнее провести различие между положительными и немечеными белками, поскольку немеченые белки в одном семействе могут перекрываться с положительными белками в других. Кроме того, белки из более мелких семейств, вероятно, будут образовывать плохо определенные кластеры. Следовательно, эти белки будет труднее правильно классифицировать, а также усложнит классификацию белков в более крупные семейства.Чтобы проверить эту теорию, из набора данных AllTargets были созданы два новых набора данных. Первый набор данных, LargeFamilies , состоял из всех белков в наборах данных GPCR, IonChannel, Kinase и Protease , а второй набор данных, SmallFamilies , состоял из всех белков в AllTargets-LargeFamilies . RF были оптимизированы для этих двух наборов данных и использовались для классификации белков в наборе данных, на котором они обучались. Среднее G для RF, оптимизированного для набора данных LargeFamilies , было 0.81, а среднее значение G для RF, оптимизированного для набора данных SmallFamilies , составило 0,76. Как и ожидалось, белки из более мелких семейств было труднее классифицировать, а белки из более крупных семейств были классифицированы со средним значением G выше, чем в наборе данных AllTargets . Эти результаты показывают, что, вероятно, именно комбинация семейств белков затрудняет точную классификацию, и что включение более мелких семейств вредно для классификации белков в целом.

    Раковые белки.

    Наилучшая комбинация параметров и набора функций для классификации белков в наборе данных Cancer составила numberTrees = 1000, mtry = 5, вес 1,3, присвоенный каждому наблюдению в положительном классе, случайное начальное число - 4

    5346116695007 и тридцать шесть функций из исходных 105 (дополнительная информация S3). Положительное сходство белков в наборе данных Cancer можно увидеть на рис.2. При использовании порогового значения 0,5 прогнозируемые классификации РФ показаны в таблице 19.

    Поскольку 55% ​​положительных белков связаны с мембраной, по сравнению с 11% немеченых белков, можно ожидать, что значительная часть неправильно классифицированных немеченых белков также связана с мембраной. Было обнаружено, что это так: 55% немеченых белков с положительным сходством> 0,5 связаны с мембраной, а 65% немеченых белков, скорее всего, являются подходящими мишенями, с положительным сходством ≥0.75, будучи мембраносвязанным. Эта тенденция связываться с мембраной также отражается в функции сорока шести немеченых белков с положительным сходством ≥0,75, поскольку большая часть из них является мембраносвязанными рецепторами, участвующими в передаче сигнала. Многие из белков также являются предполагаемыми протоонкогенами или супрессорами опухолей и часто участвуют в процессе или процессах, которые могут способствовать отличительным характеристикам рака. Например, немеченый белок с наибольшим положительным сходством представлял собой патченный гомолог 1 белка (PTCh2) (UniProt, доступ Q13635).Помимо того, что он является известным опухолевым супрессором, PTCh2 является рецептором лигандов hedgehog, которые участвуют в пролиферации и дифференцировке во время эмбриогенеза [64]. Даже если прямая связь между белком и раком является спекулятивной или неизвестной, связь между ними часто можно предположить. Например, хотя натрийзависимый транспортный белок 2B фосфата (UniProt, доступ O95436) не имеет явной онкогенной функции или функции подавления опухоли, он регулируется эпидермальным фактором роста [65], экспрессия которого часто изменяется в раковых клетках как часть их достижение нерегулируемого роста.Помимо белков, которые могут быть причинно связаны с раком, существуют другие, такие как член 3 семейства 45 растворенных носителей (UniProt, доступ Q96JT2), которые дифференциально экспрессируются при раке, но в настоящее время не считаются движущими силами рака [66,67] . Хотя связи между белками и раком обеспечивают некоторую валидацию для полезности неправильно классифицированных немеченых белков в качестве противоопухолевых мишеней, по крайней мере, один лиганд 1 запрограммированной гибели клеток 1 (UniProt, доступный Q9NZQ7), как известно, является мишенью для соединения, которое в настоящее время находится на стадии II клинические испытания в качестве противоопухолевого препарата (MPDL3280A).Все немеченые белки в наборе данных Cancer , предположительно положительные, можно найти в дополнительной информации S4. Это те белки, которые были причинно связаны с раком, но в настоящее время (2014 г.) не используются в качестве противоопухолевой мишени, и кажутся наиболее подходящими для рассмотрения в качестве будущих мишеней противоопухолевых препаратов.

    GPCR.

    Наилучшая комбинация параметров и набора функций для классификации белков в наборе данных GPCR составила numberTrees = 4000, mtry = 5, вес 12, присвоенный каждому наблюдению в положительном классе, случайное начальное число. из -45681948888140 и сорок две функции из исходной 105 (дополнительная информация S3).Положительное сходство белков в наборе данных GPCR можно увидеть на рис. 3. Используя пороговое значение 0,5, предсказанные RF классификации показаны в таблице 20.

    Как и в случае с результатами анализа признаков в наборе данных GPCR , распределение положительных сходств белков в наборе данных, вероятно, будет сильно искажено присутствием пахучих / обонятельных GPCR. Из 421 одоранта / обонятельного GPCR в наборе данных 419 получили положительное сходство ниже 0.1, причем все 421 имеют положительное подобие менее 0,5. Чтобы оценить влияние на классификации включения одорантов / обонятельных GPCR в набор данных, новый набор данных, GPCR_NO , был построен из всех белков в наборе данных GPCR , которые не являются пахучими / обонятельными рецепторами. Лучшая комбинация параметров и набора функций для классификации белков в наборе данных GPCR_NO была numberTrees = 4000, mtry = 5, вес 3.6 дано каждому наблюдению в положительном классе, случайное начальное число -251746180866936552 и сорок семь признаков из исходных 105 (дополнительная информация S3).

    Нижнее среднее значение G для РФ, обученного на наборе данных GPCR_NO , указывает на то, что различия между положительными и немечеными белками не так велики, как должны были бы показать результаты, полученные с использованием набора данных GPCR (Таблица 21). Положительные и немеченые GPCR на самом деле очень похожи после удаления пахучих веществ, что можно увидеть по большому перекрытию и относительно низкой частоте их положительного сходства (рис.4) и небольшой эффект их различий (таблица 11).

    Используя пороговое значение 0,5, можно увидеть существенные различия в классификациях непахучих GPCR RF, обученными на наборах данных GPCR и GPCR_NO (таблицы 10 и 11). Хотя RF, обученный на наборе данных GPCR , неправильно классифицировал рецепторы одорантов, удаление одорантов из набора данных привело к тому, что на 49 меньше немеченых белков было ошибочно классифицировано как положительных. Хотя это может показаться нелогичным, на самом деле это неудивительно.Это связано с тем, что наличие большой субпопуляции немеченых одорантов позволяет увеличить вес, придаваемый положительным наблюдениям, тем самым улучшая чувствительность RF за счет увеличения количества неправильно классифицированных немеченых белков. Поскольку только немеченые белки, не имеющие запаха, будут неправильно классифицированы из-за несходства одорантов и положительных белков, результирующее снижение специфичности будет небольшим и может быть более чем компенсировано увеличением чувствительности.Следовательно, удаление одорантов не только сведет на нет искусственное повышение специфичности, которое они обеспечивают, но также потребует снижения веса положительных белков. Необходимость в этом снижении можно увидеть в том факте, что использование веса 12, как это было сделано для набора данных GPCR , приводит к неправильной классификации большого количества немаркированных непахучих веществ (Таблица 10). Поскольку G-среднее для РФ, обученного на наборе данных GPCR_NO , значительно более чувствительно к неправильно классифицированным немеченым белкам, из-за меньшего количества немеченых белков в наборе данных, количество неправильно классифицированных немеченых белков должно быть уменьшено, чтобы достичь респектабельный G имею в виду.Однако повышение специфичности, которое это обеспечивает, будет сопровождаться значительным снижением чувствительности и, следовательно, более низким средним значением G.

    Из двадцати трех немеченых белков с наибольшей вероятностью быть подходящими мишенями для лекарственных препаратов, с положительным сходством ≥0,75, 15 относятся к GPCR класса A, 7 - к классу B и 1 - к классу C. Независимо от класса GPCR экспрессируются преимущественно. в головном мозге и центральной нервной системе. Что касается лигандов неправильно классифицированных немеченых белков, семь из двадцати трех являются рецепторами-сиротами без известного лиганда, тогда как остальные являются преимущественно рецепторами нейротрансмиттеров и нейропептидов (в соответствии с их тенденцией экспрессироваться в головном мозге).Все немеченые белки в наборе данных GPCR_NO , предположительно положительные, можно найти в SI3.

    Ионных каналов.

    Наилучшая комбинация параметров и набора функций для классификации белков в наборе данных IonChannel была numberTrees = 1000, mtry = 10, вес 1,2, присвоенный каждому наблюдению в положительном классе, случайное начальное число из 26412313492

    133 и сорок функций из исходных 105 (дополнительная информация S3).Положительное сходство белков в наборе данных IonChannel можно увидеть на рис. 5. Распределение белков в наборе данных IonChannel , вероятно, указывает на сильное сходство между положительными и немечеными белками, поскольку нет особенно большие пики в любом из интервалов, более крайние интервалы (0,0–0,1 и 0,9–1,0). При использовании порогового значения 0,5 прогнозируемые классификации РФ показаны в таблице 22.

    Из десяти немеченых белков с наибольшей вероятностью быть подходящими мишенями для лекарств белки с положительным сходством ≥0.75, шесть из них, как известно, управляются по напряжению, три - с лигандом, а один - с неизвестным стробированием. Из управляемых по напряжению каналов два являются селективными для кальция, три - для калия и один - для натрия, при этом оба калиевых канала являются внутренними выпрямляющими. Все три закрытых лигандами канала были селективными в отношении катионов, при этом лигандами были цинк для одного канала и серотонин для двух других. Все немеченые белки в наборе данных IonChannel , предположительно положительные, можно найти в SI3.

    киназ.

    Наилучшая комбинация параметров и набора функций для классификации белков в наборе данных Kinase составила numberTrees = 1000, mtry = 5, вес 23, присвоенный каждому наблюдению в положительном классе, случайное начальное число. из -6712145332927501964 и тридцать две функции из исходной 105 (дополнительная информация S3). Положительное сходство белков в наборе данных киназы можно увидеть на рис. 6. Распределение белков в наборе данных киназы , вероятно, указывает на то, что существует сильное сходство между положительными и немечеными белками, поскольку нет особенно большие пики в любом из бункеров, более крайних бункеров (0.0–0,1 и 0,9–1,0). При использовании порогового значения 0,5 прогнозируемые классификации РФ показаны в таблице 23.

    Две четкие тенденции можно различить, посмотрев на типы киназ в наборе данных Kinase (Таблица 14). Во-первых, атипичные (то есть не Ser, Thr или Tyr) киназы являются плохими мишенями. Из двадцати семи киназ, известных как атипичные, только одна является мишенью для одобренного лекарства. Точно так же только одна немеченая атипичная киназа ошибочно классифицируется как положительная, хотя с положительным сходством <0.75. Таким образом, среди сорока девяти немеченых киназ, которые с наибольшей вероятностью могут быть подходящими мишенями, нет атипичных киназ, имеющих положительное сходство ≥0,75. Вторая четкая тенденция - это преимущественное воздействие на тирозинкиназы. Несмотря на то, что только 14% всех киназ известного типа являются тирозинкиназами, они составляют 43% положительных киназ известного типа. Кроме того, если включены неправильно классифицированные немеченые белки, то 73 из 90 киназ, которые, как известно, являются тирозинкиназами, являются мишенями или считаются подходящими мишенями в будущем.Дополнительным доказательством непропорциональной важности тирозинкиназ как мишеней для лекарств является тот факт, что 31% неправильно классифицированных немеченых белков и 53% немеченых белков с положительным сходством ≥0,75 являются тирозинкиназами.

    В дополнение к типу киназы неправильно классифицированные немеченые белки разделяют с положительными белками тенденцию связываться с мембраной. Хотя 17% немеченых и 34% положительных белков являются мембранными белками, 24% немеченых белков с положительным сходством> 0.5 соток. Однако из немеченых белков с положительным сходством ≥0,75 двадцать (41%) связаны с мембраной. Это дополнительно подчеркивает влияние тирозинкиназ на прогнозирование мишеней киназных лекарственных средств, поскольку девятнадцать из двадцати неправильно классифицированных мембраносвязанных немеченых белков с положительным сходством ≥0,75 являются рецепторными тирозинкиназами. При рассмотрении рецепторных и нерецепторных тирозинкиназ по отдельности, рецепторные тирозинкиназы составляют самую большую часть ошибочно классифицированных немеченых белков с положительным сходством ≥0.75. Важность связывания с мембраной для вероятности того, что киназа является подходящей мишенью для лекарственного средства, поэтому, вероятно, в большей степени отражает важность того, чтобы быть рецепторной тирозинкиназой. Все немеченые белки в наборе данных киназы , предположительно положительные, можно найти в дополнительной информации S3.

    Протеазы.

    Наилучшая комбинация параметров и набора функций для классификации белков в наборе данных Protease составила numberTrees = 1000, mtry = 10, вес 20, присвоенный каждому наблюдению в положительном классе, случайное начальное число из 8716758538734970127 и следующих тридцати пяти характеристик из исходных 105 (дополнительная информация S3) Положительное сходство белков в наборе данных Protease можно увидеть на рис.7. Распределение белков в наборе данных Protease , вероятно, указывает на сильное сходство между положительными и немечеными белками, поскольку нет особенно больших пиков в каких-либо более крайних ячейках (0,0–0,1 и 0,9– 1.0). При использовании порогового значения 0,5 прогнозируемые классификации РФ показаны в таблице 24.

    Как видно из Таблицы 25, распределение типов всех неправильно классифицированных протеаз близко следует таковому для всего набора данных Protease , а не набора положительных белков.Однако, если рассматривать только те немеченые протеазы, которые с наибольшей вероятностью могут стать подходящими мишенями для лекарственных препаратов, то есть протеазы с положительным сходством ≥0,75, распределение типов неправильно классифицированных немеченых белков будет намного ближе к таковому для положительных белков. Например, хотя четыре немеченые аспарагиновые протеазы классифицированы неправильно, ни одна из них не имеет положительного сходства ≥0,75. Аналогичным образом, хотя 34% всех неправильно классифицированных немеченых протеаз являются металлопротеазами, 50% неправильно классифицированных немеченых протеаз с положительным сходством ≥0.75 соток. Потенциальные лекарственные мишени с положительным сходством ≥0,75 также более похожи на положительные белки с точки зрения их склонности к связыванию с мембраной. В то время как 23% всех неправильно классифицированных немеченых белков связаны с мембраной, 36% немеченых белков с положительным сходством ≥0,75 находятся в хорошем соответствии с 35% положительных белков, которые связаны с мембраной. Небольшое количество неправильно классифицированных немеченых белков с более надежными прогнозами, вероятно, связано с небольшим количеством положительных белков.По мере увеличения набора положительных белков вполне вероятно, что то, что составляет сходство с положительным белком, начнет расширяться, и большее количество немеченых белков будет считаться потенциальными мишенями для лекарств. Точно так же, по мере того как неметаллопротеазы начинают составлять больше из набора положительных белков, доля наиболее достоверных предсказаний потенциальных мишеней лекарств, которые являются металлопротеазами, вероятно, будет уменьшаться. Все немеченые белки в наборе данных Protease , предположительно положительные, можно найти в S4 Supplementary Information.

    Однородность набора данных.

    Чтобы дополнительно прояснить причины различий в средних G для RF, была оценена однородность каждого набора данных. Для каждого набора данных парная идентичность последовательностей между всеми парами белков в наборе данных была рассчитана с использованием BLAST. Белки в паре считались подобными, если их парная идентичность последовательностей составляла не менее 20%. Этот порог был выбран, поскольку он обычно является самым низким порогом, при котором выравнивание последовательностей все еще может считаться разумной оценкой гомологии.Поскольку максимальное количество похожих пар, исключая идентичные пары, для набора из N белков составляет процентное соотношение всех возможных пар из двух положительных белков, двух немеченых белков, одного положительного и одного немеченого белка, которые похожи, можно рассчитать для каждый набор данных. Этот процент указывает на уровень сходства между белками в данном наборе, а более высокий процент указывает на то, что белки в наборе более похожи и взаимосвязаны. Результаты сравнения сходства можно увидеть в Таблице 26.

    Из результатов видно, что наборы данных с большим процентом похожих пар, наборы данных GPCR_NO и Kinase , вызывают RF с низким средним G. Высокий процент схожих межклассовых пар, вероятно, будет особенно проблематичным для классификации RF, поскольку это указывает на то, что положительные и немеченые белки очень похожи и, вероятно, их труднее разделить и хорошо классифицировать. Эту проблему лучше всего можно увидеть в различиях между результатами для наборов данных GPCR и GPCR_NO .Хотя межклассовое сходство в наборе данных GPCR высокое, оно на шесть процентных пунктов меньше, чем в наборе данных GPCR_NO . Кроме того, хотя 291 не одорант составляет 41% немеченых белков, они участвуют в 57% подобных межклассовых пар, а 421 одорант - в 43%. Таким образом, можно увидеть, что пахучие вещества гораздо менее похожи на положительные белки, чем немаркированные непахучие вещества, и, вероятно, образуют сильно взаимосвязанный кластер, отдельный от второго кластера непахучих веществ.Таким образом, удаление одорантов из набора данных удалит большой источник белков, которые было относительно просто правильно классифицировать, а также подчеркнет истинное сходство между белками, которые потенциально могут служить мишенями (не одоранты). Это приведет к существенно более низкому среднему значению G для RF, обученного на наборе данных GPCR_NO , по сравнению с тем, которое обучено на наборе данных GPCR .

    В отличие от наборов данных GPCR_NO и Kinase , набор данных AllTargets имеет очень низкие проценты для всех типов пар, но все же вызывает RF с низким средним G.Эта низкая производительность указывает на то, что наборы данных по белкам могут вызывать неэффективные RF из-за того, что они слишком разнородны, а также из-за того, что они слишком однородны. Однако в случае разнородных наборов данных, вероятно, проблематичным является низкий уровень внутриклассового сходства, поскольку при низком уровне внутриклассового сходства кластеризация, на которую РФ полагается для обеспечения точных классификаций, отсутствует. Кроме того, сильно разнородные наборы данных приведут к тому, что отдельные деревья в лесу будут демонстрировать большую дисперсию в их классификациях данного подпространства признаков, что приведет к менее надежным совокупным прогнозам.

    Хотя не было трудностей с получением большого G-среднего для RF, индуцированных из набора данных Protease , большая доля металлопротеаз в положительных белках и высокий уровень сходства между ними могут оказаться проблематичными. Глядя на сходство между конкретными субпопуляциями набора данных Protease (Таблица 27), можно увидеть, что сходство между белками в наборе данных в основном внутритиповое, то есть между двумя металло или двумя неметалло-протеазами.Из 9231 пары белков в наборе данных, которые похожи, только 185 (2,0%) пар включают одну металло- и одну неметаллопротеазу. Отсутствие сходства особенно заметно для пар положительных белков, где только 2 (0,6%) пары сходных белков состоят из металло- и неметалло-протеаз. Эти результаты демонстрируют, что набор данных Protease разделен как минимум на два кластера, один из металло и один из неметаллопротеаз, причем кластер неметаллопротеаз потенциально может содержать дополнительные подкластеры (например, сериновые протеазы).Хотя такая кластеризация окажется проблематичной для анализа важных характеристик в наборе данных Protease , поскольку не существует единого кластера «белков, подобных лекарственным мишеням», нет никаких оснований ожидать, что это окажется проблематичным для RF-классификации, поскольку RF могут легко работать с наборами данных, которые содержат отдельные кластеры в отдельных подпространствах.

    Взаимодействие белка с водой и функциональные свойства

  • 1.

    Conway, B.E., Dev. Макромол. Chem. 7: 113 (1972).

    Google ученый

  • 2.

    Фрэнкс, в «Водные отношения продуктов питания», под редакцией Р. Б. Дакворта, Academic Press, 1975, с. 3.

  • 3.

    Клотц И.М., Science 128: 815 (1958).

    Артикул CAS Google ученый

  • 4.

    Kuntz, I.D., and W. Kauzmann, Adv. Protein Chem. 28: 239 (1974).

    CAS Google ученый

  • 5.

    Линг, Г.Н., в «Вода и водные растворы», Р.А. Хорн, редактор, Wiley (Interscience), Нью-Йорк, 1972, стр. 663.

    Google ученый

  • 6.

    McLaren, A.D., and J.W. Роуэн, Дж. Полим. Sci. 7: 289 (1951).

    Артикул CAS Google ученый

  • 7.

    Танфорд, К., «Физическая химия макромолекул», Wiley, Нью-Йорк, 1961, с. 339.

    Google ученый

  • 8.

    Берендсен, H.J.C., в «Вода, всеобъемлющий трактат», т. 5, Под редакцией Ф. Франкса, Пленум, 1975, с. 293.

  • 9.

    Гал С., «Водные отношения продуктов питания», под редакцией Р.Б. Дакворта, Academic Press, 1975, с. 139.

  • 10.

    Bruhauer, P.H., P.H. Эмнетт, Э. Теллер, J. Am. Chem. Soc., 60: 309 (1938).

    Артикул Google ученый

  • 11.

    Hansen, J.R., J. Agric. Food Chem., 24: 1136 (1976).

    Артикул CAS Google ученый

  • 12.

    Berline, E., P.G. Климан и М.Дж.Палланш, J. Colloid Interface Sci., 34: 488 (1970).

    Артикул Google ученый

  • 13.

    Деван Р.К. и В.А. Bllomfield, J. Dairy Sci. 56:66 (1973).

    CAS Статья Google ученый

  • 14.

    Кениг, С.Х. и У. Schillinger, J. Biol. Chem. 244: 3283 (1969).

    CAS Google ученый

  • 15.

    Wang, J.H., J. Am. Chem. Soc. 76: 4755 (1954).

    Артикул CAS Google ученый

  • 16.

    Buontempo, U., G. Careri, and P. Fasella, Biopolymers. 11: 519 (1972).

    Артикул CAS Google ученый

  • 17.

    Кунц, И.Д., Т.С. Брассфельд, Г.Д. Лоу, Г.В. Перселл, Science 163: 1329 (1969).

    Артикул CAS Google ученый

  • 18.

    Кук Р. и И.Д. Kuntz, A. Rev. Biophys. Bioeng.g. 3:95 (1974).

    Артикул CAS Google ученый

  • 19.

    Mellon, E.F., A.H. Korn, S.R. Hoover, J. Am. Chem. Soc. 71: 2761 (1949).

    Артикул CAS Google ученый

  • 20.

    Leeder, J.L. Watt, J. Phys. Chem. 69: 3280 (1965).

    Артикул CAS Google ученый

  • 21.

    Kuntz, I.D., J. Am. Chem. Soc. 93: 514 (1971).

    Артикул CAS Google ученый

  • 22.

    Полинг, Л., Там же. 67: 555 (1945).

    Артикул CAS Google ученый

  • 23.

    Лидер, Дж.Д. и Л. Watt, J. Colloid Interface Sci. 48: 339 (1974).

    Артикул CAS Google ученый

  • 24.

    Спонслер О.Л., Дж. Д. Бат и Дж. У. Эллис, J. Phys. Chem. 44: 966 (1940).

    Артикул Google ученый

  • 25.

    Speakman, J.B., Trans. Faraday Soc. 40: 6 (1944).

    Артикул CAS Google ученый

  • 26.

    Bull, H., and K. Breese Arch. Biochem. Биофиз. 128: 488 (1968).

    Артикул CAS Google ученый

  • 27.

    Hermansson, A.M., Lebensm.-Wiss. Technol. 5:24 (1972).

    CAS Google ученый

  • 28.

    Hermansson, A.M., J. Texture Stud. 5: 425 (1974).

    Артикул Google ученый

  • 29.

    Hermansson, A.M., C. Akesson, J. Food Sci. 40: 595 (1975).

    Артикул CAS Google ученый

  • 30.

    Иглэнд, Д., в «Водные отношения продуктов питания», под редакцией Р.Б. Дакворта, Academic Press, 1975, с. 73.

  • 31.

    Melander, W., and C. Horvath, Arch. Biochem. Биофиз. 183: 200 (1977).

    Артикул CAS Google ученый

  • 32.

    Хамм, Р., в «Мясе» под редакцией Д.Дж.А. Коул и Р.А. Лори, Баттервортс, Лондон, 1975.

    Google ученый

  • 33.

    Шерман П., Food Technol. 15:79 (1961).

    Google ученый

  • 34.

    Ackler, L.W., Ibid. 23: 241 (1969).

    Google ученый

  • 35.

    Chou, H.E., and W.M. Breene, J. Food Sci. 37:66 (1972).

    Артикул CAS Google ученый

  • 36.

    Дакворт, Р. Б., «Водные отношения продуктов питания», Academic Press, Нью-Йорк, 1975, стр. 1.

    Google ученый

  • 37.

    Лабуза Т.П., Food Technol. 22:15 (1968).

    Google ученый

  • 38.

    Лабуза, Т.П., Труды 3-го Международного конгресса по технологиям пищевых продуктов, IFT, стр.618.

  • 39.

    Labuza, T.P., S.R. Танненбаум, М.К. Карен, Food Tech. 24: 543 (1970).

    Google ученый

  • 40.

    Okamota, S. and K. Matsuura, J. Jpn. Soc. Food Sci. Technol. 21: 239 (1974).

    Google ученый

  • 41.

    Koury, G.J., and J. Spinelli, J. Food Sci. 40:58 (1975).

    Артикул CAS Google ученый

  • 42.

    Waugh, D.F., Adv. Protein Chem. 9: 325 (1954).

    CAS Google ученый

  • 43.

    Kauzmann, W., Ibid. 14: 1 (1959).

    CAS Google ученый

  • 44.

    Richards, F.M., J. Mol. Биол. 82: 1 (1974).

    Артикул CAS Google ученый

  • 45.

    Drenth, J., J.N. Янсониус, Р. Коэкоек и Б.G. Walthers, Adv. Protein Chem. 25:79 (1971).

    CAS Google ученый

  • 46.

    Ресинг, Х.А. и Р.А. Neihof, J. Colloid Interface Sci. 34: 480 (1972).

    Артикул Google ученый

  • 47.

    Tanford, C., Adv. Protein Chem. 24: 2 (1970).

    Google ученый

  • 48.

    Ferry, J.D., Adv. Protein Chem.4: 1 (1948).

    CAS Статья Google ученый

  • 49.

    Паури, У.Д., и М.А. Тунг, в «Водные отношения продуктов питания», Р. 249.

  • 50.

    Суггетт, А., в «Водные отношения продуктов питания», под редакцией Р.Б. Дакворта, Academic Press, Нью-Йорк, 1975, с. 23.

    Google ученый

  • 51.

    Стейнсби, Г., в «Симпозиуме гелеобразователей и гелеобразующих агентов», Британская ассоциация исследований пищевой промышленности, 1972, с.1.

  • 52.

    Bratton, G.B., H.L. Hopkins, and J.W. Вайнберг, Наука, 147, 738 (1965).

    Артикул CAS Google ученый

  • 53.

    Коуп, Ф.В., Biophys. J. 9: 303 (1969).

    CAS Статья Google ученый

  • 54.

    Hazelwood, C.F., B.L. Николс, Н.Ф. Чемберлен, Nature 22: 747 (1969).

    Артикул Google ученый

  • 55.

    Ling, G.N., and W. Negendank, Physiol. Chem. Phys. 2:15 (1970).

    CAS Google ученый

  • 56.

    Catsimpoolas, N, E.W. Meyer, Cereal Chem. 9: 599 (1970).

    Google ученый

  • 57.

    Cooke, R., and R. Wein, Ann. N.Y. Acad. Sci. 204: 197 (1973).

    Артикул CAS Google ученый

  • 58.

    Свифт, Т.Дж., Э.М.Барр, Там же. 204: 191 (1973).

    Артикул Google ученый

  • 59.

    Hansen, J.R., Biochem. Биофиз. Acta., 230: 482 (1971).

    CAS Google ученый

  • 60.

    Fleming, S.E., F.W. Sosulski, A. Kilava, and E.S. Humbert, J. Food Sci. 39: 188 (1974).

    Артикул Google ученый

  • 61.

    Hamm, R., Adv. Food Res. 10: 355 (1960).

    CAS Google ученый

  • 62.

    Миллер У.О., Р.Л. Соффл и С.Б. Zirkle, Food Technol. 22: 1139 (1968).

    Google ученый

  • 63.

    Wierbicki, E., L.E. Кункель, П. Deatherage, Там же. 11 (2): 69 (1957).

    CAS Google ученый

  • Набор данных о физико-химических свойствах третичной структуры белка

    "- // W3C // DTD HTML 4.01 Переходный // RU \ ">

    Репозиторий машинного обучения UCI: набор данных по физико-химическим свойствам третичной структуры белка

    Набор данных о физико-химических свойствах третичной структуры белка
    Загрузить : Папка данных, описание набора данных

    Abstract : Это набор данных о физико-химических свойствах третичной структуры белка. Набор данных взят из CASP 5-9.Всего 45730 манков размером от 0 до 21 армстронг.

    Характеристики набора данных:

    Многомерный

    Количество экземпляров:

    45730

    Площадь:

    Жизнь

    Характеристики атрибута:

    Настоящее

    Количество атрибутов:

    9

    Дата дарения

    31.03.2013

    Связанные задачи:

    Регрессия

    Отсутствующие значения?

    НЕТ

    Количество веб-посещений:

    64419

    Источник:

    Prashant Singh Rana, psrana '@' gmail.com , ABV - Индийский институт информационных технологий и менеджмента, Гвалиор, член парламента, Индия.

    Информация о наборе данных:

    Предоставьте всю необходимую информацию о вашем наборе данных.

    Информация об атрибуте:

    RMSD-Размер остатка.
    F1 - Общая площадь поверхности.
    F2 - Неполярная незащищенная зона.
    F3 - Фракционная площадь незащищенного неполярного остатка.
    F4 - Дробная площадь незащищенной неполярной части остатка.
    F5 - Площадь экспонирования, взвешенная по молекулярной массе.
    F6 - Среднее отклонение остатков от стандартной открытой площади.
    F7 - Евклидово расстояние.
    F8 - Штраф вторичной конструкции.
    F9 - Ограничения пространственного распределения (значение N, K).

    Соответствующие документы:

    НЕТ


    Запрос цитаты:

    См. Машинное обучение Политика цитирования репозитория


    Поддерживается:

    В сотрудничестве с:

    О нас || Политика цитирования || Политика пожертвований || Контакты || CML .

    Related Posts

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

    2021 © Все права защищены.